[发明专利]与肝癌预后相关的血清miRNA标志物及其检测试剂盒的应用

说明书

本发明公开了一种与肝癌预后相关的血清miRNA标志物及其检测试剂盒的应用。该肿瘤标志物为人类肝癌患者相关的血清miR‑29a‑3p和miR‑192‑5p。本发明前期工作经过高通量深度测序，筛选出了包含miR‑29a‑3p和miR‑192‑5p在内的表达差异明显的肝癌相关血清miRNA表达谱，并且经定量PCR(qPCR)验证，最终确认血清miR‑29a‑3p和miR‑192‑5p是肝癌危险度(预后)相关的肿瘤标志物。本发明的标志物和检测试剂可用于制备快速检测定量PCR试剂盒，具有检测快速方便，准确率高、无创伤等特点；并且miR‑29a‑3p、miR‑192‑5p及肝癌巴塞罗那分期(BCLC stage)三者联合构建的预后模型，可用于肝癌患者危险度高低的分级分层，从而指导肝癌病人个体化治疗。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种血清miRNA的检测产品以及miR-29a-3p和miR-192-5p作为肝癌危险度(预后)肿瘤分子标记物的应用。

背景技术

肝癌是我国排名第二的常见恶性肿瘤，因为是乙肝感染大国，因而每年新发患者众多，新发病人数占世界约50％，且具有早期症状不明显，进展迅速，复发转移率高等特点。现有TNM分期及甲胎蛋白AFP并不能很好地指导患者预后，很多早期患者即使手术之后，也常常容易复发转移，迫切需要新的分子标记物来指导患者预后，达到危险度分级分层的目的，从而指导个体化治疗。

肿瘤标志物(tumor marker，TM)是指在恶性肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤反应而异常产生和/或升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶(同工酶)、多胺及癌基因产物等，存在于病人的血液、体液、细胞或组织中，可用生物化学、免疫学及分子生物学等方法进行测定，对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、观察疗效、监测复发以及预后评价具有一定的价值。一些标记物起到监测肿瘤可能容易复发，自然病程快速进展等预测患者病情进程的作用，称之为肿瘤预后标记物。

肝癌预后，是指肝癌患者从诊断确立的开始到最终(死亡)的病情进展过程，比如说进展快慢，复发早晚，生存长短，简而言之就是从整个病情进展状态来评价最终结局的好与坏。

肝癌的预后标志物，就是揭示或预示病情发展进程往好的方面发展，还是往坏的方面发展的生物标记物质，又分不良预后标志物和良好预后标志物，携带了不良预后标志物，提示病人病情发展进程中，病情进展迅速，复发转移情况较多较早，生存时间较短；反之，携带了良好预后标志物，提示病情发展缓慢，复发转移较少较晚，生存时间较长。简而言之，预后标记物就是从肿瘤病人病情总体的概括出发，外在方面，揭示病情危险度高中低的趋势情况；内延方面，揭示了肿瘤病情生物学异质性差异，导致的肿瘤生物学行为恶性高低的不同。

微小RNA(microRNA，miRNA)来源于长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA在细胞核中经酶切作用，形成具有茎环结构的miRNA前体，miRNA前体转运至胞质后，被进一步加工成miRNA；成熟的miRNA在特定的宿主细胞内与脂质或脂蛋白结合形成微囊泡，以外切酶体形式分泌至胞外，经体液微循环，被内吞入特定的受体细胞内发挥特定调节功能；肿瘤相关miRNA可能来源于肿瘤细胞死亡、溶化或肿瘤细胞向周围环境所释放的miRNA；miRNA可在转录后水平通过与靶基因特异性的碱基互补配对，引起靶基因的降解或者抑制其翻译，调控癌基因和/或抑癌基因的表达，广泛参与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化侵袭、迁移血管生成等，与多种肿瘤的发生发展及预后关系密切。因此，有学者提出了“癌microRNA”(OncomiRs)的观点，即认为某些miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展中充当了类似癌基因的角色。

血清中的含量远低于组织，需要一种非常灵敏且特异的检测方法；又由于引物序列短，引物设计比较困难，没有针对性的软件可以直接利用，没有标注化的内参基因做参照，故引物、反应体系及内参体系均需筛选及优化过程。目前针对miRNA的高通量筛查一般采用芯片技术，成本高、特异性和灵敏度有限，且不能满足零散标本实时检测需求。

发明内容