[发明专利]一种新型隐球菌荚膜多糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种新型隐球菌荚膜多糖 (Glucuronoxylomannan，GXM)抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

新型隐球菌(CrytococcusNeoformans)是一种重要的条件致病菌,常感染免疫能 力低下或免疫能力缺陷的患者,导致以中枢神经系统感染为主的深部真菌感染，病死率很 高。美国疾病预防与控制中心(CDC)于1992-1993年进行的大系列流行病学研究显示,深部 真菌感染的年发病率为178.3/百万。其中,隐球菌病为65.5/百万,约占36.7％。

近年来由于广谱抗菌药物、肾上腺皮质激素、肿瘤化疗、放疗和器官移植后免疫抑 制剂的长期广泛应用，以及艾滋病的流行，隐球菌病明显增多。新型隐球菌性脑膜炎(以下 简称“隐脑”)就是由新型隐球菌所致的最常见的中枢神经系统疾病，占隐球菌病的80％左 右。隐脑的临床表现复杂，症状不典型，因而很难诊断，约80％的隐脑患者会被误诊为结核 性脑膜炎。

新型隐球菌荚膜多糖(Glucuronoxylomannan，GXM)是引起病理变化的主要毒性因 子。在菌体生长和繁殖过程中，GXM被不断分泌到胞外,通过免疫抑制作用和免疫调理作用 从而影响宿主的免疫系统。国外实验室已开展了检测血液和脑脊液中GXM的研究，使隐脑的 早期诊断率得以提高。

目前国际上开展的GXM的检测方法主要有以下3大类：

1)印度墨汁染色法：该法敏感性差，阳性检出率很低，局限性大；

2)血培养或脑脊液培养等培养的方法：该法敏感性差，阳性检出率不高；

3)免疫学检测法：用特异性针对GXM的抗体实现对新型隐球菌的检测，检测血液和 脑脊液的敏感性都能达到85％以上。

免疫学检测方法的灵敏度和特异性都较前两种方法有明显的优势，正逐渐成为新 型隐球菌检测的常用方法。

免疫检测技术是利用抗原抗体间能特异性结合反应，通过检测标记在反应物上的 标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测的方法。根据标记物质的不同，分为酶联免疫分 析技术(Enzyme-LinkedImmunosorbantAssay,ELISA)、免疫荧光检测技术、化学发光免疫 分析技术、免疫微球技术、免疫胶体金技术等。其中ELISA技术具有操作简单、灵敏度高、检 测时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。

在新型隐球菌的临床检测中，目前国际市场上有为数不多的免疫检测产品，如： IMMY公司的乳胶凝集法产品和胶体金法产品，Bio-Rad公司的乳胶凝集法产品，Meridian公 司的乳胶凝集法和ELISA法检测试剂盒产品。Meridian公司的ELISA试剂盒采用双抗夹心 法，其方法是先将隐球菌的特异多克隆抗体包被在酶标板上，再加入待检样本与多克隆抗 体反应，37℃反应10min，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体，37℃反应10min， 待检样本中的抗原会与特异单克隆抗体结合并形成夹心结构，再加入显色底物显色，颜色 的深浅和待检抗原的浓度呈正相关，从而实现GXM的检测。我国国内并没有真正用于新型隐 球菌临床检测的免疫学检测产品。因此，在新型隐球菌临床检测领域内，迫切需要一种国内 自主研发的定量检测GXM的诊断试剂盒产品。

发明内容

本发明一个目的在于提供一种新型隐球菌荚膜多糖抗原免疫检测试剂盒，所述 GXM免疫检测试剂盒包括：GXM包被的酶标载体、抗GXM多克隆酶标抗体、GXM标准品。

所述的GXM是从新型隐球菌培养液中提取纯化得到的，所述的提取为将酸化后的 新型隐球菌培养液加入乙醇沉淀得到GXM粗提物，所述的纯化方法为亲和免疫层析法。

所述的GXM的提取，包括如下步骤：

(1)培养新型隐球菌，至菌浓度达到对数期后期；

(2)将菌液高压灭菌，离心除去菌体，保留上清液；

(3)向上清液中边搅拌边缓慢加入醋酸钙粉末，然后加冰醋酸调pH至酸性；

(4)向步骤(3)得到的溶液中加入乙醇，4℃静置过夜，离心，弃去上清，干燥沉淀， 得到GXM粗提物。

所述的GXM的纯化是通过使用新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱进行的，包 括如下步骤：

(1)用20倍柱床体积与待纯化抗原溶液相同的缓冲液洗柱；