[发明专利]赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因及其应用

说明书

一、技术领域

本发明提供了一个赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因及应用，属于植物基因工程领 域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。

二、背景技术

目前，生产上黄萎病危害十分严重，是棉花、番茄、辣椒、茄子等植物的主要真菌病 害，造成减产甚至绝收，尚无有效的防治措施。黄萎病的病原主要为大丽轮枝菌 (Verticilliumdahliae)，以微菌核(microsclerotia)形式长期存在于土壤中。黄萎病菌 在寄主植物上会表现出致病性差异，在与寄主相互作用、协同进化及生态环境差异的影响 下，常产生生理分化，出现新的致病类型。张天真等用RAPD指纹图谱聚类分析将我国棉花黄 萎病菌株划分为8类，但是同一类中可能同时含有强中弱致病菌，说明黄萎病致病机制十分 复杂(张天真,2000)。另外，由转座子和DNA水平转移等引起黄萎病菌的遗传变异也限制了 棉花抗黄萎病育种(AmyotteSG，etal.,2012；deJonge,etal.,2012)。因此，克隆抗性基 因、解析抗病机制对抗黄萎病育种意义重大而迫切。

然而，目前对黄萎病具有抗性的基因较少，尤其对棉花黄萎病具有稳定广谱高抗 的基因未见报道。Fradin等(2011)将番茄中Ve1转化拟南芥，获得了对黄萎病菌的抗性，而 该基因转化烟草和棉花后，不具有黄萎病抗性，表明该基因在植物上的应用具有物种特异 性(刘琳琳等，棉花与番茄抗棉花黄萎病不依赖于Ve1，中国科学:生命科学，2014(44)卷第8 期:803-814)。从抗黄萎病海岛棉品种H7124中克隆了与番茄Ve1基因(Fradinetal., 2009)和棉花GbVe基因(Zhangetal.,2011)部分同源的Gbve1基因，该基因也具有典型的 植物抗病蛋白结构域，利用VIGS沉默Gbve1基因可使海岛棉H7124对黄萎病的抗性丧失；并 且，Gbve1基因转化拟南芥和陆地棉的结果都表明Gbve1基因对强致病力的落叶型和非落叶 型黄萎病菌都具有抗性(Zhangetal.,2012a)，但是并未获得高抗黄萎病品种。除了Ve基 因外，一些下游防卫相关基因也用于抗黄萎病防治研究。过量表达AtNPR1基因的转基因棉 花对非落叶型黄萎病具有抗性，但是对落叶型黄萎病不具有抗性(Parkhietal.2010)。另 外，水稻黄单胞菌harpin蛋白、几丁质酶基因、脂质转移酶基因、天麻抗真菌蛋白、抗菌肽、 防御素(θ-Defensins)(Miaoetal.,2010；Munis,2010；NiMetal.,2013)也对黄萎病表 现出一定的抗性，但是由于防卫基因的过量表达对植物生长发育带来一些不利影响、以及 抗性效果未达到预期目标等，从而限制了这些基因在生产上的应用。

本研究通过陆地棉高抗黄萎病品种奥3503的转录组进行分析，发现一个受黄萎病 侵染诱导表达的基因LRK2，该基因与雷蒙德氏棉LYK2-Like基因(Gossypiumraimondii proteinLYK2-like，登录号XM_012602491)相似度98％，以该基因的序列为模板设计引物 将LRK2基因克隆，并将该基因转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株对落叶型以及非落叶 型菌系均具有较高的抗性。棉花黄萎病抗性基因LRK2的分离可以进一步丰富抗性基因资 源，对其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个赋予植物黄萎病抗性LRK2基因的应用，该基因编码 一个表面受体蛋白，受黄萎病病原菌诱导后表达量显著增加。该基因表达可以显著提高受 体植物对落叶黄萎病病原菌V991以及非落叶型黄萎病菌BP2的抗性。可以利用本发明基因 构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。

技术方案

赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因，其序列为SEQIDNO.1。该基因来源于陆地棉品 种奥3503。LRK2基因完整编码框长度为2016个碱基，编码蛋白含671个氨基酸，分子量为 74KD，等电点为7.85。

本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片 段的引物。