[发明专利]普通生酮基古龙酸菌速生型产酸菌株的高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物菌种选育方法，特别是一种普通生酮基古龙酸菌速生型产 酸菌株的高通量筛选方法。

背景技术

维生素C是人体必需的维生素，生理作用广泛，在医药和食品工业中均占有重要地 位。目前国内普遍采用“二步发酵法”生产，第一步：单菌发酵，将D-山梨醇转化成L-山梨糖； 第二步：混合菌发酵，通过普通生酮基古龙酸菌Ketogulonogeniumvulgarum(俗称小菌)和 巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium(俗称大菌)的共同作用将L-山梨糖转化成2-酮基-L- 古龙酸；2-酮基-L-古龙酸再经过提取和转化生成维生素C。

在“二步发酵法”生产维生素C的过程中混合菌发酵，通过普通生酮基古龙酸菌和 巨大芽孢杆菌的共同作用将L-山梨糖转化成2-酮基-L-古龙酸是生产维生素C的关键步骤， 它决定着维生素C的发酵产率和成本，在此过程中，普通生酮基古龙酸菌是产酸菌，巨大芽 孢杆菌是伴生菌，不产酸，因此选育普通生酮基古龙酸菌速生型产酸菌株，缩短发酵周期， 就成为节能降耗、提高设备利用率、增大维生素C产量的关键。

但是普通生酮基古龙酸菌的产酸性能受多基因控制，需要经过多轮次的诱变选育 和大覆盖面的批量筛选才能得到正突变菌株，通常使用的筛选方法为：将经过诱变处理的 菌体悬浮液稀释后均匀涂布于常规的分离培养基平板上培养，然后挑取存活的单菌落采用 划线法进一步富集培养，再分别接种于种液培养基和发酵培养基中进行产酸性能检测，根 据每个菌株的生长产酸情况判定取舍。这样的方法存在以下不足：一是经过诱变处理，即使 是产酸性能得到改变的菌株其菌落形态和菌体形态等表型特征也几乎没什么改变，难以鉴 别，因此对正突变菌株的挑选没有目的性，而为了避免漏选，对诱变后存活的单菌落基本上 是全部选择，筛选量巨大；二是进行菌株生长代谢检测采用的培养容器为装液量和容积比 较大的试管或三角瓶，要求待检菌株的量也相应较大，需要先将单菌落做富集培养，这样不 仅又增加了3天左右的培养时间，而且还增加培养装置。基于上述原因，为了简化筛选工艺、 提高筛选效率和准确性，建立一套新的普通生酮基古龙酸菌速生型产酸菌株的高通量筛选 方法，就成为当前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有普通生酮基古龙酸菌速生型产酸菌株选育技术 的不足，而提供一种基于特征指示剂鉴别与离心管组培养技术相结合、简便、快速、高效高 通量选育普通生酮基古龙酸菌速生型产酸菌株的方法，即一种普通生酮基古龙酸菌速生型 产酸菌株的高通量筛选方法。

本发明的目的可以通过下述的技术方案来实现：

这种基于特征指示剂鉴别与离心管组培养技术相结合、简便、快速、高效高通量选 育普通生酮基古龙酸菌速生型产酸菌株的方法，包括如下步骤：

(1)以普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonogeniumvulgarum)为出发菌株进行诱变 处理，获取经诱变处理的菌体悬浮液；

(2)将经过诱变处理的菌体悬浮液稀释后涂布于含有一定剂量指示剂的鉴别用固 体培养基平板上，31±3℃静置培养48～96h；

(3)从鉴别用固体培养基平板上生长出的普通生酮基古龙酸菌单菌落中挑取在静 置培养期内周围培养基出现变色圈且颜色由蓝绿变为黄色的单菌落，分别接种于一支装有 含有一定剂量指示剂的鉴别用种液培养基的离心管中，每N支离心管组成一个离心管组，作 为一个培养单元置于摇床中，31±3℃振荡培养，期间根据离心管中种液的颜色变化，挑取 在较短时间内颜色由蓝绿变为黄色的离心管中种液作为高产酸种液；

(4)将挑取的高产酸种液稀释后涂布于分离培养基平板上，31±3℃静置培养48～ 72h，挑取饱满个大的单菌落进行扩大培养，即得到纯化高产的普通生酮基古龙酸菌速生型 产酸菌株；

所述鉴别用固体培养基的组成为：山梨糖10～20g/L、酵母膏2～6g/L、玉米浆2～ 6g/L、蛋白胨5～10g/L、尿素0.5～2g/L、MgSO₄·7H₂O0.05～0.2g/L、KH₂PO₄0.5～2g/L、 CaCO₃0.5～2g/L、指示剂0.01～0.1g/L、琼脂10～25g/L，pH7.0～7.5；