[发明专利]铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白Vac9的纯化方法

权利要求书

1.一种铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗抗原Vac9，其特征在于，该 抗原的核酸序列如SEQIDNO：1所示，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

2.权利要求1所述抗原的纯化方法，其特征在于，所述方法包括：

1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac9的菌体；

2)将步骤1)收集的菌体破菌，离心，收集上清；

3)将步骤2)得到的上清液通过GST亲和层析进行亲和纯化；其中，在所 述亲和层析中缓冲液洗脱使用PrescissionProtease酶进行酶切；

4)步骤3)处理后的重组蛋白Vac9用A液进行样品处理；

5)步骤4)处理后的重组蛋白Vac9进行PhenylHP层析柱纯化，其中，使 用B液平衡层析系统及PhenylHP层析柱，用C液线性梯度洗脱；

6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac9进行G25层析柱纯化；其中，采用D 液平衡G25层析系统及层析柱，分离纯化重组蛋白，置换缓冲液；

7)将步骤6)纯化后的重组蛋白Vac9进行QHP去内毒素，其中，在D缓 冲液平衡层析系统及QHP层析柱内去除内毒素，分离纯化重组蛋白Vac9；

其中，A液为pH7.5的含20mMPB，3M(NH₄)₂SO₄的缓冲液，B液为pH7.5 的含20mMPB，2M(NH₄)₂SO₄缓冲液；C液为的pH7.520mMPB溶液；D液为pH6.0 的含10mML-组氨酸，0.9％NaCl，0.1％Trtionx-100缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤2)的具体方法是将 培养的细菌以PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)缓冲液悬浮，预冷后采用高压均质破菌， 在4℃条件下，10,000-15,000g高速离心15-30min，收集上清，所述的高压均 质破菌压力为60-80MPa。

4.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤3)所述GST亲和纯 化方法是：先用GST亲和填料进行初步结合，接着用10-20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄， 1MNaClpH7.0-7.5缓冲液清洗，再用PP酶进行酶切，最后用10-20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH7.0-7.5缓冲液对目标蛋白进行洗脱；所述GST亲和层析使用的填 料为GST-琼脂糖凝胶4B或GST-琼脂糖凝胶4FF或GST-琼脂糖凝胶HP。

5.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤4)所述的样品处理 是：步骤3)所得重组蛋白Vac9与A液按体积比1∶2进行混合，A液滴加到重 组蛋白Vac9溶液，边滴边搅拌。

PP酶会针对目的蛋白与GST标签间的酶切位点发生作用，而自身与GST标 签结合，从而达到酶切分离目的蛋白的效果。

6.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤5)所述的PhenylHP 层析纯化是：用B液平衡层析系统及PhenylHP层析柱，上样步骤4)处理后的 样品，上样后用B液冲洗未结合蛋白，直至基线平稳，再用C液线性梯度洗脱； 其中，PhenylHP层析柱的填料为PhenylSepharoseHP或PhenylSepharose6FF 或CaptoPhenylImpRes。

7.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤6)所述的G25层析 是：用D液平衡层析系统及G25层析柱，将步骤5)纯化获得的样品，上样， 分离纯化重组蛋白Vac9，置换缓冲液；其中G25层析柱的填料为SephadexG-25 Coarse或SephadexG-25Medium或SephadexG-25Fine或SephadexG-25 Superfine。