[发明专利]铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白Vac9的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及铜绿假单胞菌(PA)疫苗重组蛋白Vac9 (OprL)的纯化方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，为非发酵 菌中的假单胞菌属，广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，在医 院病房及医疗器械中也普遍存在，是临床上最为常见的条件致病菌之一。由于 PA在临床上的高感染率和耐药率的不断攀升，寻找新的“非抗生素疗法”迫在 眉睫，从免疫学角度入手，研制开发出安全有效的疫苗成为最为理想的选择。

OprL为铜绿假单胞菌的肽聚糖相关蛋白(peptidoglycanassociated lipoprotein)，其位于铜绿假单胞菌的外膜，在细菌的生理和病理过程中发挥 重要的作用。OprL蛋白在铜绿假单胞菌中高度保守，已经有研究将其作为铜绿 假单胞菌的诊断靶点(Xu，J.等.Clin.Microbiol.Antimicrob.2004)。同 时有研究发现在病人的血清中发现有抗OprL的抗体的存在(Montor，W.R等， InfectImmun2009)，此外OprL还能诱导小鼠产生保护性Th17免疫应答反应 (Wu，W等，AmJRespirCritCareMed2012)。鉴于这些因素，OprL可以作 为良好的基因工程疫苗候选抗原。

申请人采用基因工程技术克隆通过大肠杆菌基因工程菌表达获得铜绿假单 胞菌(PA)疫苗重组蛋白Vac9(OprL)，所述重组蛋白经动物试验证明，可有效 刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用，有利于铜绿假单胞 菌的预防、诊和治疗。目前，尚未见针对该重组蛋白Vac9的纯化方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白Vac9 的纯化方法。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好， 回收率较好。

本发明的技术方案是：

一种铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗抗原Vac9，其核酸序列如SEQID NO：1所示，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗抗原Vac9的纯化方法，包括以下步 骤：

1)收集构建表达基因工程蛋白Vac9的大肠杆菌工程菌高密度发酵的菌体；

2)将步骤1)收集的菌体破菌，离心，收集上清；

3)将步骤2)得到的上清液通过GST亲和层析进行亲和纯化；其中，在所 述亲和层析中缓冲液洗脱使用PrescissionProtease酶进行酶切；

4)步骤3)处理后的重组蛋白Vac9用A液进行样品处理；

5)步骤4)处理后的重组蛋白Vac9进行PhenylHP层析柱纯化，其中，使 用B液平衡层析系统及PhenylHP层析柱，用C液线性梯度洗脱；

6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac9进行G25层析柱纯化；其中，采用D 液平衡G25层析系统及层析柱，分离纯化重组蛋白，置换缓冲液；

7)将步骤6)纯化后的重组蛋白Vac9进行QHP去内毒素，其中，在D缓 冲液平衡层析系统及QHP层析柱内去除内毒素，分离纯化重组蛋白Vac9；

其中，A液为pH7.5的含20mMPB，3M(NH₄)₂SO₄的缓冲液，B液为pH7.5 的含20mMPB，2M(NH₄)₂SO₄缓冲液；C液为的pH7.520mMPB溶液；D液为pH6.0 的含10mML-组氨酸，0.9％NaCl，0.1％Trtionx-100缓冲溶液。

步骤2)的具体方法是将培养的细菌以PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)缓冲液悬 浮，预冷后采用高压均质破菌，在4℃条件下，10,000-15,000g高速离心 15-30min，收集上清，所述的高压均质破菌压力为60-80MPa，；