[发明专利]一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法

权利要求书

1.一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述方法包括：

1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体；

2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离心，收集上清；

3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化；其中，在所述亲和层析中A液进行洗脱，使用Prescission Protease酶进行酶切；

4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化；其中，使用A液平衡层析系统及Q HP层析柱，使用B液线性梯度洗脱；

5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析柱纯化；其中，采用C液平衡G25层析系统及层析柱，分离纯化重组蛋白，置换缓冲液；

6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化，加入0.1％Triton X-100混匀，采用D液平衡层析系统及Q HP层析柱,去除杂质；

其中，A液为pH7.0-7.5的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，B液为pH7.0-7.5的含1M NaCl的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液；C液为pH6.0的含10mM L-组氨酸，0.9％NaCl的溶液；D液为pH6.0的10mM L-组氨酸，0.9％NaCl，0.1％Triton X-100溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的：

将收集表达重组蛋白Vac33的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10mM的PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，4℃，以10,000～15,000g的转速高速离心，收集上清。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中以60～80MPa的高压破菌。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的GST亲和层析的层析柱的填料选自Glutathione Sepharose4B、Glutathione Sepharose4FF或Glutathione SepharoseHP中的一种。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述Prescission Protease酶带有GST标签。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的Q HP层析柱的填料选自QSepharose HP、QSepharose FF或CaptoQ中的一种。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中洗脱流速为15ml/min，洗脱梯度为B液从0到100％。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述的G25层析柱的填料选自Sephadex G-25 Coarse或Sephadex G-25 Medium、Sephadex G-25 Fine或Sephadex G-25Superfine中的一种。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述的Q HP层析柱的填料选自QSepharose HP、Q Sepharose FF或Capto Q中的一种。