[发明专利]一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法

说明书

本发明提供了一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法，所述方法包括：1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体；2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离心，收集上清；3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化；4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化；5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析柱纯化；6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化。本发明的纯化方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33 (PcrV-OprI)的纯化方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，感染可发生在人体任何部位和组织，常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道，可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症，该菌目前已成为ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，全身感染死亡率在20％以上。

目前在PA疫苗方面已开展了广泛研究，但普遍存在抗原类型单一、免疫保护效果低下等问题，尚无一种疫苗进入临床应用。PcrV是铜绿假单胞菌III 型分泌系统的重要组件之一，它能够形成同源多聚体，组装成分泌系统运输毒力因子和效应蛋白的“管道”，是铜绿假单胞菌III型分泌系统的关键组件 (Teiji S.等，Critical Care 2014)，鉴于PcrV在铜绿假单胞菌致病中的重要作用，该蛋白已成为铜绿假单胞菌感染治疗性抗体针对的重要靶标。OprI蛋白为铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白(outer membrane lipoprotein)，其位于铜绿假单胞菌的外膜，在细菌的生理和病理过程中发挥重要的作用。发明人构建了一种既能很好去除PA这些蛋白对细胞的毒性，又能保持这些蛋白抗原性的重组双亚单位基因工程重组蛋白Vac33。目前，尚未见针对该重组双亚单位基因工程蛋白Vac33疫苗纯化方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌(PA)重组双亚单位基因工程蛋白 Vac33疫苗的纯化方法。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法，所述方法包括：

1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体；

2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离心，收集上清；

3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化；其中，在所述亲和层析中A液洗脱使用Prescission Protease酶进行酶切；

4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化；其中，使用A 液平衡层析系统及Q HP层析柱，使用B液线性梯度洗脱；

5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析纯化；其中，采用C 液平衡G25层析系统及层析柱，分离纯化重组蛋白，置换缓冲液；

6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化，加入0.1％Triton X-100混匀，采用D液平衡层析系统及Q HP层析柱,去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质；

其中，A液为pH7.0-7.5的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，B液为 pH7.0-7.5的含1MNaCl的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液；C液为pH6.0的含 10mM L-组氨酸，0.9％NaCl的溶液；D液为pH6.0的10mM L-组氨酸，0.9％NaCl， 0.1％Triton X-100溶液。