[发明专利]中华按蚊烯醇化酶结合蛋白基因及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中华按蚊烯醇化酶结合蛋白(EBP)基因及其制备方法。

背景技术

疟疾是由疟原虫引起的一种流行广泛，危害严重的虫媒传染病，与艾滋病 和结核病一起被列为世界上最具威胁的三大传染病，在全球100多个国家和地 区流行，30多亿人受疟疾感染危险，每年约有2亿多病例，近60万人死亡。寻 找和研发安全有效的疟疾疫苗或治疗新药物，将成为全球和我国消除疟疾的急 迫需求。

与艾滋病和结核病不同的是，疟疾必须通过媒介按蚊才能进行传播。疟疾 是由疟原虫引起的，其中，恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)引起的疟疾主 要由冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)和斯氏按蚊传播，间日疟原虫(Plasmodium vivax)引起的疟疾主要由中华按蚊和斯氏按蚊传播。中华按蚊(Anopheles sinensis)是疟疾和马来丝虫病的重要传播媒介，不仅分布于我国除新疆和青海 以外的全国各省区，还在东南亚和西太平洋地区广泛分布，是水稻种植地区的 优势蚊种，是我国中部间日疟流行区的主要传疟媒介，在我国的种群数量大。 中华按蚊是我国重要的媒介生物，有效控制中华按蚊对控制相关疾病的传播具 有重要的意义。

烯醇化酶(enolase)最初发现是细胞糖酵解中的关键酶之一，后来发现它 能够表达在疟原虫表面并不依赖于其酶活性通过与按蚊上未知蛋白结合介导疟 原虫侵入媒介按蚊，从而在按蚊体内发育成具有感染性疟原虫而传播疟疾。最 近Vega-RodríguezJ等发现在冈比亚按蚊上与恶性疟原虫烯醇化酶(enolase)相 互结合的蛋白enolase-bindingprotein(EBP)，并且发现EBP是恶性疟原虫侵入 冈比亚按蚊所必须的，为相关控制冈比亚按蚊传播恶性疟药物开发奠定了基础。 我国中部间日疟流行区的主要传疟媒介是中华按蚊，为开发相关控制间日疟药 物，我们在间日疟原虫的媒介宿主中华按蚊上发现鉴定了与间日疟原虫烯醇化 酶(enolase)相互结合的蛋白enolase-bindingprotein(EBP)基因序列，与冈比 亚按蚊上与恶性疟原虫烯醇化酶(enolase)相互结合的蛋白enolase-binding protein(EBP)序列进行了差异比对，并且对其在中华按蚊各个发育阶段和各个 组织分布进行了研究。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种中华按蚊烯醇化酶 结合蛋白基因及其制备方法。

按照本发明提供的技术方案，一种中华按蚊烯醇化酶结合蛋白基因，特征 是：所述中华按蚊烯醇化酶结合蛋白基因如SEQIDNo：1所示；所述中华按蚊 烯醇化酶结合蛋白基因的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。

所述中华按蚊烯醇化酶结合蛋白基因的制备方法，特征是，包括以下步骤：

(1)采用中华按蚊成蚊mRNA反转录获得cDNA模板；

(2)以cDNA为模板，采用引物F1和F2经PCR反应体系进行扩增；所 述引物F1的序列为：cagtnctnggntgncnttgntcncttcg，其中n为a、t、g或c；所述 引物F2的序列为cgancngntgnttnggnntcacnggntg，其中n为a、t、g或c；

(3)扩增产物进行加尾反应，得到EBP基因部分序列，然后采用引物对 F3和F4、F5和F6扩增EBP3‘和5’端序列；最后使用引物F7和F8扩增出 全长EBP基因。

进一步的，所述PCR反应体系包括：1μlcDNA模板、1μl引物F1、1μl引 物F2、2μl10×buffer、3μl25mMMgCl₂、4μl2mMdNTPs、1μlTaq聚合酶和7μl 水。

进一步的，所述步骤(2)扩增过程为：94℃、4min；94℃、30sec；50℃、 30sec；72℃、1min，共30个循环；72℃、7min；4℃、12min。

进一步的，所述步骤(3)加尾过程为：向步骤(2)的扩增产物中加入0.5 μldATP及普通TaqDNA聚合酶，混匀后置于72℃孵育60min进行加尾反应。