[发明专利]人羧酸酯酶1的生物发光探针底物及其制备方法与应用

权利要求书

1.一类人羧酸酯酶1的生物发光探针底物，其特征在于：该探针底物DBT-R可被人羧酸酯酶1(hCE1)特异性催化发生酯键水解反应并生成相应的羧酸产物DBTC，该探针底物和水解产物的结构如下：

其中，R¹为-N(CH₃)₂，R²为H,R³为甲基。

2.按照权利要求1所述人羧酸酯酶1的生物发光探针底物，其特征在于：所述DBTC是荧光素酶的底物，可采用生物发光检测器实现产物的快速灵敏检测，所述生物发光检测器为发光分析仪、酶标仪、显微镜或小动物成像仪。

3.按照权利要求1所述人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：

将1.0eq的2-氰基苯并噻唑和1.1-1.5eq的D-半胱氨酸加入到甲醇/水的混合溶液中，加入1.1-1.5eq的碳酸钾，20-30℃搅拌反应1-3小时，生成(S)-4,5-二氢-2-(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸化合物，简称DBTC；

将所得产物1.0eq的DBCT在0.1-0.5eq 4-N,N-二甲基吡啶和1.1-1.5eq的1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺的存在下与醇(HOR³)缩合反应，20-30℃搅拌反应6-24小时生成(S)-4,5-二氢-2-(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物，简称DBT-R。

4.按照权利要求1所述人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的应用，其特征在于，该类底物可被hCE1特异性识别并催化发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量即可测定不同生物来源中的hCE1活性，其检测步骤如下：

(1)预孵育：将待测样品在缓冲体系中，20～60度下孵育3～5分钟；

(2)起始反应：加入探针底物DBT-R混匀，20～60度下孵育2～120分钟；

(3)检测：加入荧光素酶检测试剂，混匀，37℃孵育20-30min，用酶标仪或化学发光分析仪测定样品。

5.按照权利要求4所述人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的的应用，其特征在于：所述水解反应体系为PBS缓冲液，探针底物的浓度介于1/10～10K_m之间，孵育体系pH介于5.5-10.5之间，反应温度介于20-60℃之间。

6.按照权利要求4所述人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的的应用，其特征在于：所述不同生物来源为重组表达的hCE1、人或动物的细胞制备物、组织制备液、血浆。

7.按照权利要求4所述人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的应用，其特征在于：所述水解产物的生成率在0.1％～20％之间。

8.按照权利要求1所述人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的应用，其特征在于：该探针用于人羧酸酯酶1抑制剂的快速筛选与评估，方法为：按照探针的使用方法，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物的生成量评估该生物体系中hCE1的残余活性，进而实现hCE1抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。