[发明专利]人羧酸酯酶1的生物发光探针底物及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一类人羧酸酯酶1的生物发光探针底物及其制备方法与应用，属生物医药技术领域。该探针底物为(S)‑4,5‑二氢‑2‑(苯并噻唑‑2‑基)噻唑‑4‑甲酸酯衍生物(简称DBT‑R)，其可用于测定不同生物体系中hCE1的酶活。hCE1酶活性测定的具体流程如下：选择DBT‑R化合物酯键水解反应为探针反应，在生理条件下定量检测单位时间内DBT‑R水解生成羧酸产物DBTC的量来测定各类生物样品中hCE1的活性。本发明可用于检测各种生物样本(离体组织、细胞、血浆、在体及整体器官、甚至活体动物)中hCE1酶的实际活性。本发明不仅可用于不同来源生物样本中hCE1酶活性的定量评估，此外借助该探针反应还可用于体外快速筛选hCE1的诱导剂和抑制剂。

技术领域

本发明属医药生物技术领域，具体涉及一类一类人羧酸酯酶1(hCE1)的生物发光探针底物及其制备方法与应用。

背景技术

作为脏器和组织的特征标志物，hCE1在人群的肝脏中含量很高，其蛋白表达量在肝脏分布蛋白中排前十位。hCE1是一种膜结合蛋白，定位于细胞内质网中【CANCERRESEARCH 1998；58:3627-32&Drug Metab.Pharmacokinet.2006；21:173-85】，同时也会分泌到细胞外进入血液循环系统【Proteomics 2009；9:3989–99】。hCE1的基本代谢反应是催化含较小醇基和较大酰胺基底物的水解。虽然，在多种组织的中都检测到hCE1的蛋白表达，但其在人肝脏组织含量远高于其它组织。hCE1参与多种外源性物质的代谢清除，例如药物奥司他韦、哌醋甲酯等。同时，hCE1在维持人体正常生理功能功能发挥不可忽视的作用，参与人体内胆固醇酯和游离脂肪酸的运输和代谢过程，维持脂质代谢平衡【Chemistry&Biology,Vol.10,341–349,April,2003】。在正常健康人体中，hCE1除了以较高的含量分布在肝组织的细胞中，也有少量hCE1在血浆中被检测到，更重要的是，肝细胞肝癌患者血浆中的hCE1是健康人群的2-5倍，因此hCE1被认为是肝细胞肝癌早期诊断的一种良好的潜在血清学标志物【Proteomics 2009,9,3989–3999】。此外，肝细胞破损相关的肝脏疾病患者也会有hCE1释放入血，引起血浆中hCE1浓度发生变化，因此，血浆中hCE1可作为肝脏急性损伤的标志物。hCE1的分布存在很大的个体差异，hCE1酶的表达和功能本身会受到人体遗传、年龄、疾病、性别、环境和共服药物等多种因素的影响。因此，hCE1酶的活性检测方法具有广阔的临床应用前景，可用于评价人体肝脏功能异常、药物及毒物导致的肝毒性、肝细胞癌早期诊断、肝功能个体化评估、以及部分前体药物的个性化使用等。此外，hCE1作为维持人体脂质代谢平衡的重要蛋白，其抑制剂可作为降血脂药物使用，hCE1也被FDA批准为重要的药物作用靶点。hCE1活性的快速表征方法也可用于新药研发早期发现及评估hCE1新型高效抑制剂。因此，开发高效、超灵敏、高特异性的hCE1活性检测方法对于临床样本中hCE1活性的检测，以及新药高内涵高通量筛选至关重要。

本发明提供了(S)-4,5-二氢-2-(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物(简称DBT-R)及其作为hCE1探针底物的应用，其经hCE1水解后可生成荧光素酶的底物(S)-4,5-二氢-2-(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸化合物(简称DBTC)，利用DBTC与荧光素酶反应产生生物发光进行检测。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活性及抑制剂活性评价快速省时的特点。

发明内容

本发明的目的在于提供人羧酸酯酶1(hCE1)的特异性生物发光探针反应及其定量检测方法和应用，该类特异性探针的水解产物是荧光素酶的底物，易于检测。利用该探针反应可对多种生物体系中的hCE1的分布和功能进行定量评价。

一类人羧酸酯酶1的生物发光探针底物，该探针底物DBT-R可被hCE1特异性催化发生酯键水解反应并生成相应的羧酸产物DBTC，该探针底物如图1，水解产物的结构如下：