[发明专利]土壤蛋白酶的测定方法

权利要求书

1.土壤蛋白酶的测定方法，其特征在于：该测定方法按以下步骤进行：

一、试剂配制：分别配制0.10mol/L～0.15mol/L NaOH溶液，0.10mol/L～0.15mol/LKH₂PO₄溶液；

二、配制磷酸盐缓冲溶液：取步骤一配制的NaOH溶液790mL～795mL和KH₂PO₄溶液1000mL～1010mL混合，调节pH至7.40～7.42；

三、配制明胶溶液：将明胶研磨粉碎，量取700mL～710mL步骤二配制的磷酸盐缓冲溶液加热至80℃～85℃，称取研磨好的明胶10.0g～10.4g溶解于加热后的磷酸盐缓冲溶液中，溶解后冷却定容到1L；

四、配制铜盐溶液：首先配制0.15mol/L～0.17mol/L CuCl₂溶液，再配制0.18mol/L～0.19mol/L Na₂HPO₄溶液，向Na₂HPO₄溶液中加入NaOH，使其pH在8.0～8.5；然后配制0.28mol/L～0.29mol/L Na₂B₄O₇溶液，向Na₂B₄O₇溶液中加入0.08mol/L～0.12mol/L盐酸，使其pH在6.0～6.5，静置待用；

五、土样的培养：准确称取采自田间的农田黑土10.01～10.04g，烘干制成土样，用孔径为2mm的筛子过筛，然后将过筛后的土样置于容器中，用移液管准确加入甲苯4mL±2μL，放置13min～17min，然后加入步骤三配制的明胶溶液39mL～41mL；再用保鲜膜将容器口封好，放置已预热37℃～38℃恒温箱中，培养23h～25h；

六、测定：将步骤五培养的土样过滤，取10mL～12mL滤液于50mL～100mL离心管中，加水10mL～15mL，依次用移液管准确加入步骤四配制的CuCl₂溶液4mL±2μL、Na₂HPO₄溶液8mL±2μL和Na₂B₄O₇溶液8mL±2μL，将离心管盖好，充分混匀，溶液由蓝色变成蓝紫色后离心，4000r/min～4500r/min离心4min～5min，离心完毕后，取上清液在分光光度计650nm处测定吸光度值；

七、甘氨酸标准液的配制和标准曲线的绘制：配制甘氨酸标准液，以甘氨酸浓度为横坐标，测得的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线；

八：结果计算：以每克烘干土样在24h内酶解蛋白质释放的NH₃-N的质量来表示蛋白酶活性Pro：Pro＝a·V·n/m，式中：a为由标准曲线求的NH₃-N浓度，单位为μg/mL；V为显色液体积，单位为mL；n为分取倍数；m为烘干土重，单位为g。

2.根据权利要求1所述的土壤蛋白酶的测定方法，其特征在于：步骤五加入甲苯4mL。

3.根据权利要求1所述的土壤蛋白酶的测定方法，其特征在于：步骤五加入步骤三配制的明胶溶液40mL。

4.根据权利要求1所述的土壤蛋白酶的测定方法，其特征在于：步骤六用移液管准确加入步骤四配制的CuCl₂溶液4mL、Na₂HPO₄溶液8mL和Na₂B₄O₇溶液8mL。

5.根据权利要求1所述的土壤蛋白酶的测定方法，其特征在于：步骤七配制甘氨酸标准液按以下步骤进行：精确称取0.2679g甘氨酸溶于蒸馏水，并准确稀释至100mL，此为甘氨酸标准溶液，1mL含500μgNH₃-N；用移液管准确吸取甘氨酸标准液10mL于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，即得100μgNH₃-N/mL的标准液；然后分别吸取稀释5倍标准液0、2、4、6、8和10mL于50mL～100mL离心管中，加水稀释至20mL～25mL；依次用移液管准确加入步骤四配制的CuCl₂溶液4mL±2μL、Na₂HPO₄溶液8mL±2μL和Na₂B₄O₇溶液8mL±2μL；将离心管盖好，充分混匀，由蓝色变成蓝紫色后离心，4000r/min～4500r/min离心4～5min；离心完毕后，取上清液在分光光度计650nm处测定吸光度值。