[发明专利]土壤蛋白酶的测定方法

说明书

土壤蛋白酶的测定方法，本发明涉及蛋白酶的测定方法，特别是涉及一种土壤蛋白酶的测定方法。本发明的目的是为了解决测定蛋白酶活性的准确性较低的问题。本发明的土壤蛋白酶的测定方法按以下步骤进行：一、试剂配制；二、配制磷酸盐缓冲溶液(PBS)；三、配制明胶溶液；四、配制铜盐溶液；五、土样的培养；六、测定；七、甘氨酸标准液的配制和标准曲线的绘制；八：结果计算。本发明土壤蛋白酶的测定方法提高了土壤蛋白酶活性测定的准确性。本发明的土壤蛋白酶的测定方法用于蛋白酶的测定。

技术领域

本发明涉及蛋白酶的测定方法，特别是涉及一种土壤蛋白酶的测定方法。

背景技术

蛋白酶能够将蛋白质、肽类分解为氨基酸，是土壤中的一种重要的胞外酶，该酶具有离体活性，能够参与土壤的氮素循环。在进入土壤的植物残体和施入的有机肥料中，含有一定数量的蛋白物质，土壤蛋白酶能对这类物质进行酶促分解，因此，可用蛋白酶来表征土壤的氮素状况及其转化进程。

测定土壤蛋白酶活性的方法中——荷夫曼(Hoffmann)方法(也叫铜盐比色法)，是目前比较常用的测定土壤蛋白酶活性的方法。该方法采用水溶解的1％明胶培养，然后用加入按比例混合好的铜-磷酸盐溶液，酶解后释放的氨基酸与铜盐反应形成蓝色复合物，用分光度计进行比色，计算氨基酸含量，进而分析蛋白酶活性。但是该方法存在许多的不足，首先，1％明胶基质培养的效果不够好，测得的结果不够稳定，其次，铜磷酸盐按照一定比例混合好进行反应生成蓝色的复合物的效果不够明显，导致测定的结果不够准确。土壤蛋白酶活性测定的过程中受试验试剂的影响较大，导致目前荷夫曼方法测定蛋白酶活性准确性较低。

发明内容

本发明的目的是为了解决测定蛋白酶活性的准确性较低的问题，提供了一种土壤蛋白酶的测定方法。

本发明的土壤蛋白酶的测定方法按以下步骤进行：

一、试剂配制：分别配制0.10mol/L～0.15mol/L NaOH溶液，0.10mol/L～0.15mol/L KH₂PO₄溶液；

二、配制磷酸盐缓冲溶液(PBS)：取步骤一配制的NaOH溶液790mL～795mL和KH₂PO₄溶液1000mL～1010mL混合，调节pH至7.40～7.42；

三、配制明胶溶液：将明胶研磨粉碎，并称取10.0g～10.4g，量取700mL～710mL步骤二配制的磷酸盐缓冲溶液(PBS)加热至80℃～85℃，将研磨好的明胶溶解于加热后的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，溶解后冷却定容到1L；

四、配制铜盐溶液：首先配制0.15mol/L～0.17mol/L CuCl₂溶液，再配制0.18mol/L～0.19mol/L Na₂HPO₄溶液，向Na₂HPO₄溶液中加入NaOH用来调节溶液的pH值，使其pH在8.0～8.5；然后配制0.28mol/L～0.29mol/LNa₂B₄O₇(无水四硼酸钠)溶液，加入0.08mol/L～0.12mol/L盐酸，用来调节溶液的pH值，使其pH在6.0～6.5，静置待用；

五、土样的培养：准确称取采自田间的农田黑土10.01～10.04g，烘干制成土样，用孔径为2mm的筛子过筛，然后将过筛后的土样置于容器中，用移液管准确加入甲苯4mL±2μL，放置13min～17min，然后加入步骤三配制的明胶溶液39mL～41mL；再用保鲜膜将容器口封好，放置已预热37℃～38℃恒温箱中，培养23h～25h；