[发明专利]齿瓣石斛均一多糖的分离纯化及一级结构鉴定方法

说明书

由于齿瓣石斛多糖粘性高，高活性多糖段分子量大，所以在其分离纯化以及结构解析方面存在一定难度。为此本发明公开了一种分离提纯齿瓣石斛均一多糖的方法，先用分步醇沉方法进行分离，然后经凝胶柱纯化，能够得到纯净的齿瓣石斛的均一多糖。另外，本发明还采用多光谱解析鉴定了齿瓣石斛均一多糖的骨架结构，能够对该多糖的一级结构准确鉴定，明确齿瓣石斛中的主要多糖为乙酰基葡甘露聚糖。

技术领域

本案涉及石斛多糖领域，尤其涉及一种分离纯化齿瓣石斛多糖的方法，以及对该多糖进行一级结构鉴定的方法。

背景技术

多糖是重要的生物活性大分子，有提高免疫力、抗炎、延缓衰老、抗氧化等功效。多糖所链接的大量亲水性羟基，使其具有强吸水性、乳化性、高黏度性。

石斛为九大仙草之首，齿瓣石斛多糖有较好的提高免疫力、抗肿瘤等功效，其多糖含量丰富，高达35-42％。前期通过实验发现，齿瓣石斛多糖与灵芝多糖相比，其抗肿瘤、提高免疫力功效更为显著。目前石斛多糖的提取方法主要是采用水提法、回流提取法、超声波/微波提取法、酶提取法、超高压提取法等。但由于齿瓣石斛多糖粘性高，高活性多糖段分子量大，在分离纯化以及结构解析方面存在一定难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离提纯齿瓣石斛均一多糖的方法，利用水提醇沉分离、凝胶柱纯化等手段，能够得到齿瓣石斛的均一多糖。

本发明的另一个目的，采用多光谱解析鉴定了齿瓣石斛均一多糖的骨架结构。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

分离提纯齿瓣石斛均一多糖的方法，将水提醇沉粗多糖先用分步醇沉方法进行分离，然后经凝胶柱纯化，得到齿瓣石斛的均一多糖。

其中采用分步醇沉方法进行分离包括：将粗多糖复溶于水，加酒精至50％进行乙醇醇沉，得到沉淀物，将该沉淀物去除，继续加酒精至体系酒精70％，得到絮状沉淀，该絮状沉淀为50-70％醇沉粗多糖片段。50-70％醇沉粗多糖片段的纯度在90％以上。

采用凝胶柱纯化包括：将50-70％醇沉粗多糖片段复溶于水，用凝胶柱进行纯化，用硫酸苯酚法跟踪监测收集，蒸发浓缩，透析，冷冻干燥，得到凝胶柱分离纯化过的均一多糖。其中优选采用superdex-200凝胶柱进行纯化；优选收集对称峰33-45管；优选采用旋转蒸发仪浓缩，浓缩时间40-80分钟。

水提醇沉粗多糖可采用如下工艺：将齿瓣石斛在水中煎煮，并进行固液分离，所得液体为水提液；向水提液中加入乙醇醇沉，使体系内乙醇浓度为70％-80％，得到粗多糖。

本发明还提供了一种齿瓣石斛均一多糖的一级结构鉴定方法：

首先用HPGPC分析仪器、高效液相色谱仪、蒸发光散射检测器ELSD测定均一多糖的分子量为1.94×10⁵Da；

然后将均一多糖甲基化衍生，利用气相色谱-质谱联用仪与单糖标准品对照，测定单糖组成；单糖组成中甘露糖:葡萄糖的摩尔比为0.77:0.23；

最后通过核磁分析推断糖苷键→4)-man-(1→，→4)-Glc-(1→和→4)-2-o-acetyl-man-(1→的比值为：1.46:1.74:1.00。核磁谱图结构分析如下：

根据碳谱信号，石斛多糖的异头碳信号峰为δ101.3，通过de pt135图谱，可以确定C6的信号峰为δ61.7；C2，C3，C4，C5的化学位移分布在δ70～80ppm区域内；δ77.76信号峰应归属于C4，由此推测出石斛多糖的链接方式可能为1,4-Man；

另外，在δ20.3-21.0和δ172.9-173.9有信号峰，应归属于乙酸根的甲基和羰基信号，由此推断在石斛多糖的多糖结构中，C2，C3对应的羟基可能由乙酸根取代；