[发明专利]一组用于猪源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针

权利要求书

1.一组用于猪源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引 物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：

（1）、上游引物：5'-ACGATTCTTCGCCTTTCACT-3'

下游引物：5'-GGGGTGTAGTTGTCTGGGTC-3'

探针：5'-ATTACCGCCCTCGCAGCCGTACA-3'

所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3；

（2）、与（1）所述序列互补的序列。

2.根据权利要求所述的引物和探针，其特征在于：所述探针的5’端荧光报告基团是 FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。

3.猪源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为猪源性的定性或定量检测试剂盒；其特征在 于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针；

作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将猪源性保 守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有猪源性保守 基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述猪源性保守基因片段为序列表中SEQID No.2；

作为进一步优选，所述猪源性保守基因片段是以序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列 为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：

上游引物：5'-TACGGTCATCACAAATCTACTATC-3'

下游引物：5'-ATATTATGCTTCGTTGTTTGG-3'；

作为优选，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35 个循环；72℃10min。

4.权利要求1或2所述的特异性引物和探针在制备定性或定量检测猪源性的试剂盒中 的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用是分别以标准品和待测样品DNA 为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判 定结果。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。

7.猪源性的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为 直接实施对象，其特征在于：步骤如下：

（1）制备标准品：将猪源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进 行诱导表达，获得含有猪源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述猪源性保守 基因片段为序列表中SEQIDNo.2；

（2）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体 系进行实时荧光PCR扩增；

（3）标准曲线绘制；

（4）通过标准曲线和待测样品的Ct值进行猪源性的快速定量检测。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述猪源性保守基因片段 是通过以下引物扩增得到的：

上游引物为5'-TACGGTCATCACAAATCTACTATC-3'；

下游引物为5'-ATATTATGCTTCGTTGTTTGG-3'；

作为优选，PCR扩增所述猪源性保守基因片段的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55 ℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min；

作为优选，步骤（2）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；

作为优选，步骤（2）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。

9.猪源性的定性PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施 对象，其特征在于：步骤如下：

（1）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时荧光PCR扩增；

（2）通过待测样品的Ct值对猪源性进行定性检测：当Ct值小于38时，为阳性；否则，为阴 性；

作为优选，步骤（1）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；

作为优选，步骤（1）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。