[发明专利]一组用于猪源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针

说明书

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一组用于猪源性实时荧光PCR检测的特 异性引物和探针。

背景技术

随着人们生活水平的提高及健康意识的增强，人们越来越关心食品的真伪性，食 品中动物及植物源性成分鉴别成为社会关注的焦点之一，消费者对肉制品和油类质量与安 全性的要求越来越高。目前个别食品行业充斥着掺假行为，特备是在利益驱动下，将低成本 的猪肉掺入到高成本的牛羊肉中更是一些不法商贩惯用的手段，也有不少不法商家将地沟 油按一定比例添加到新鲜使用的植物油中，谋取暴利，危害消费者健康。因此，建立一种可 靠的方法鉴别植物油和牛羊肉中猪源性掺假成分具有重要的实际意义和社会意义。

过去用于肉食和油类中物种的鉴别主要依赖于电泳法，免疫法，ELISA等蛋白质分 析法。这些技术对于加工混合肉制品中的猪源性成分却无法分析出，而PCR技术基于其反应 时间短，具有较高灵敏性、特异性成为鉴别加工食品中物种的优先选择。但传统的PCR技术 在定量和大批量检测中局限性较大。因此，急于发现一种新的技术可以精确地辨别物种并 实现快速、大容量的实时定量检测，而新兴的实时荧光定量PCR技术可以很好的满足要求， 正广泛的应用于食品和油脂类猪源性成分的检测。

发明内容

本发明目的在于设计一组猪源性特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于 植物油和肉食中猪源性成分检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR检测的方法。本发 明采用基因克隆技术，将猪源性DNA的cytb基因种内保守片段插入到载体pMD18-T中，获得 含有cytb基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据猪源性cytb的基因片段编码基因序 列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反 应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。

本发明的第一个目的是提供一组用于猪源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探 针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：

（1）、上游引物：5'-ACGATTCTTCGCCTTTCACT-3'

下游引物：5'-GGGGTGTAGTTGTCTGGGTC-3'

探针：5'-ATTACCGCCCTCGCAGCCGTACA-3'

所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3；

（2）、与（1）所述序列互补的序列。

作为优选，所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团 TAMRA。

本发明的第二个目的是提供猪源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为猪源性的定 性或定量检测试剂盒；所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针；

作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将猪源性保 守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有猪源性保守 基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述猪源性保守基因片段为序列表中SEQID No.2；

作为进一步优选，所述猪源性保守基因片段是以序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列 为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：

上游引物：5'-TACGGTCATCACAAATCTACTATC-3'

下游引物：5'-ATATTATGCTTCGTTGTTTGG-3'；

作为优选，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35 个循环；72℃10min。

本发明的第三个目的是提供特异性引物和探针在制备定性或定量检测猪源性的 试剂盒中的应用。

作为优选，所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探 针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。

作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、 60℃40s并收集荧光信号，40个循环。

本发明的第四个目的是提供猪源性的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法 不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下：