[发明专利]一种在高山被孢霉中表达异源ω-3脱饱和酶的重组菌株及其构建方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种在高山被孢霉中过表达来源于瓜果腐霉的ω-3脱饱和酶 oPaFADS17的基因工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。

【背景技术】

高山被孢霉(Mortierellaalpina)是一种脂质积累可以达到细胞干重50％的产油 真菌，是脂质生物化学基础研究的重要模式生物。高山被孢霉已经被应用于工业化生 产花生四烯酸(Arachidonicacid,AA,C20:4)，其生产的食用油脂已经通过美国农业部 (FDA)的安全性评估。除了合成AA之外，高山被孢霉也具有一定的合成二十碳五 烯酸(Eicosapentanoicacid,EPA,C20:5)的能力。EPA属于ω-3长链多不饱和脂肪酸 (LC-PUFAs)，具有重要的生理功能，如：促进哺乳动物大脑发育以及神经组织形成 和修复的能力，预防哮喘、癌症、抑郁、肥胖、免疫紊乱以及心血管疾病等。但是人 体自身不能合成这些脂肪酸，需要从富含ω-3LC-PUFAs的食物(如深海鱼油)中摄 取。而深海鱼类提供的ω-3LC-PUFAs存在稳定性差、纯化工艺复杂、易氧化等缺点， 且由于大肆捕捞和环境污染破坏，深海鱼类提供的ω-3LC-PUFAs已无法满足日益增 长的市场需求，所以利用微生物生产ω-3LCPUFAs已经成为当前的研究热点。

由AA合成EPA的反应是通过ω-3脱饱和酶催化完成的。不同物种来源的ω-3脱 饱和酶对催化的底物具有明显的偏好性，其中偏好催化20碳PUFAs的ω-3脱饱和酶 可以较高效的催化AA生成EPA，对于EPA的生产有十分重要的作用。2004年，Pereira 等人发现来源于异枝水霉的ω-3脂肪酸脱饱和酶sdd17，对18碳的多不饱和脂肪酸没 有催化活性，却能将20碳的AA催化为EPA，转化率为25.9％。同样的，来源于致 病疫霉的ω-3脱饱和酶OPIN17也不能以18碳的多不饱和脂肪酸为底物，但是对AA 的转化率达到了30.94％。

更高的催化AA生成EPA的转化率是本领域想要获得的，同时还期望能够降低生 产的工艺条件(例如由较早的低温培养提升为对工艺条件要求较低的常温培养)。例 如中国发明专利申请CN2015109088953公开了一株异源表达来源于细小微胞藻 CCMP1545的MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株，根据其说明书的记载，该菌株 在常温培养7天后，EPA产量达到62.2mg/L，显著高于野生型高山被孢霉。而当采 用变温培养时(同时延长低温培养时间)，其EPA产量能够进一步提高至80.1mg/L。 然而，常温环境下该EPA产量依然不能达到本领域技术人员的期望

通过过表达异源ω-3脱饱和酶基因以进一步提高重组菌中ω-3脂肪酸EPA的产 量，这对产油真菌高山被孢霉的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。

【发明内容】

本发明的目的是通过根瘤土壤杆菌介导的方法构建一株过表达来源于瓜果腐霉 的oPaFADS17基因的重组高山被孢霉工程菌株，该菌株能够在常温环境下高产EPA， 以及在高山被孢霉中过表达oPaFADS17基因的方法。

本发明还涉及将所述重组高山被孢霉工程菌株用于高转化率地工业生产EPA。

为了实现上述目的，本发明提供一株过表达ω-3脱饱和酶oPaFADS17基因的重组高山 被孢霉(Mortierellaalpina)MA-oPaFADS17-3，该菌株于2015年10月12日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11394。

在本发明中，所述ω-3脱饱和酶oPaFADS17基因是经过优化的来源于瓜果腐霉的 ω-3脱饱和酶基因，其核酸序列如SEQNO.1所示。

在本发明中，所述重组高山被孢霉菌株是以含ω-3脱饱和酶oPaFADS17基因的根 瘤土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的，特别是用含有ω-3脱 饱和酶oPaFADS17基因的重组质粒pBIG2-ura5s-oPaFADS17转化根瘤土壤杆菌后， 再以含转化质粒pBIG2-ura5s-oPaFADS17的根瘤土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养 缺陷型菌株构建而成的。

另一方面，构建上述重组高山被孢霉的方法包括以下步骤：