[发明专利]一种快速检测副鸡禽杆菌的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及试剂盒检测技术领域，具体的说涉及一种快速检测副鸡禽杆菌的试剂盒。

背景技术

副鸡禽杆菌是细小的革兰氏阴性菌，细菌长约1-3μm，宽0.4-0.8μm，无鞭毛，不形成芽孢，毒力菌株往往有荚膜。副鸡禽杆菌培养条件较为苛刻，需要在培养基中加入NAD，但在南非也发现NAD非依赖性分离株，说明NAD不是必需的营养成分。该菌兼性厌氧，在固体培养基上培养时需厌氧环境或3％-10％的CO₂。基于血凝抑制试验建立起来Page方法将副鸡禽杆菌分为A、B、C三种血清型。副鸡禽杆菌引起的疾病叫做鸡传染性鼻炎。病鸡精神委顿，垂头缩颈，食欲明显降低。最初自鼻孔流出水样汁液，继而转为浆性黏性分泌物，鸡只有时甩头，打喷嚏，眼结膜发炎，眼睑肿胀，有的流泪，一侧或两则颜面肿胀，部分病鸡可见下颌部或肉髯水肿。该病潜伏期短，传播迅速，短时间内便可波及全群。育成鸡表现为生长不良，产蛋鸡产蛋量明显下降，处在产蛋高峰期的鸡群产蛋量大幅度下降10％-40％，有时高达70％至完全停产。混合感染时可引起病鸡死亡，给养殖业造成了重大的损失。

目前进行细菌分类鉴定中常用的靶基因是16SrRNA，它是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，具有高度的保守性，16srRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。副鸡禽杆菌的生化反应复杂，不同毒力的菌株会有不同的结果；间接血凝试验虽是目前最准确有效的方法，但此方法用时较长；PCR检测方法虽然特异性强，但是需要的PCR扩增仪十分昂贵。因此，发明一种操作简便、准确快速的检测副鸡禽杆菌的方法对鸡传染性鼻炎预防和治疗具有重要意义。

环介导等温扩增基因技术(loop-mediatedisothermalamplication,简称LAMP)(国际专利公开号WO00/28082)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换型DNA聚合酶，能在等温条件下(60～65℃)，1h内特异地扩增出10⁹-10¹⁰拷贝靶序列，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选SYBRGreenI染色，即可通过肉眼判定。在保持传统PCR技术优点的基础上，进一步提高了反应的特异性，同时缩短了检测时间。国内外在病原体的检测方法，利用LAMP方法对多种动物疫病和微生物检测已有很多报告。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确度、操作简便的检测副鸡禽杆菌的试剂盒及其检测方法。

首先，本发明的第一个技术目的是提供一种高灵敏度、高特异性的用于检测副鸡禽杆菌的LAMP引物组，包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，所述的外引物F3和B3的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述的内引物FIP和BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。

在此基础上，本发明进一步提供一种简单、快速、准确的检测副鸡禽杆菌的试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点。

所述试剂盒为LAMP试剂盒，除了包含上述引物组外，还包括：LAMP缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTPs、无菌去离子水、阳性对照和阴性对照。如果采用荧光目视法时，还包括荧光染料。

优选的，本发明的试剂盒中LAMP引物组的浓度为：外引物F3和B3的浓度为5pmol/μL；内引物FIP和BIP的浓度为40pmol/μL。

更为优选的，本发明的试剂盒包括：

1)10×LAMP缓冲液；2)8000U/mLBstDNA聚合酶；3)10mMdNTPs；4)LAMP引物组；5)无菌去离子水；6)荧光染料：10×SYBRGreenI；7)阳性对照：0083、022和Modesto副鸡禽杆菌基因组DNA；阴性对照：无菌去离子水。

其中所述的10×LAMP缓冲液含有25℃下pH8.8的200mMTris-HCl、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1％的曲拉通X-100。