[发明专利]一种重组羰基还原酶ReCR、编码基因、载体、工程菌及应用

权利要求书

1.一种重组羰基还原酶ReCR，其特征在于所述重组羰基还原酶ReCR的氨基酸序列 为SEQIDNO.2所示。

2.一种权利要求1所述重组羰基还原酶ReCR编码基因，其特征在于所述编码基因 的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

3.一种由权利要求2所述重组羰基还原酶ReCR编码基因构建的重组载体。

4.一种含权利要求2所述重组羰基还原酶ReCR编码基因的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述重组羰基还原酶ReCR在生物酶法制备(S)-N-Boc-3-哌啶醇的 中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：以含重组羰基还原酶ReCR 编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎、分离纯化获得的酶为催 化剂，以N-Boc-3-哌啶酮为底物，以仲辛醇为辅助底物及有机相，以NAD⁺为辅酶，以pH6～9 的缓冲液为反应介质构成两相反应体系，在25～60℃、150～300rpm条件下反应，反应完 全后将反应液分离纯化，获得(S)-N-Boc-3-哌啶醇；所述催化剂用量以湿菌体重量计为 10～500g/L反应体系；所述底物终浓度为50～400g/L反应体系，辅酶终浓度为0.05～1.6mM， 仲辛醇体积终浓度为7～90％。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以湿菌体重量计为 50～200g/L反应体系，所述底物终浓度为100～200g/L反应体系，辅酶终浓度为0.1～0.8mM， 仲辛醇体积终浓度为20～40％。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应条件为35℃、pH8.0、300rpm。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含重组羰 基还原酶ReCR编码基因的工程菌接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中， 37℃培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，再加入终浓度为0.3mM 的IPTG，20℃诱导12h，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和10000rpm下离心10min， 弃去上清液，收集湿菌体。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述湿菌体经超声破碎、分离纯化获得的 酶按如下方法制备：(1)将含重组羰基还原酶ReCR编码基因的工程菌经发酵培养获得的 湿菌体加入pH8.0、Tris-HCl缓冲液中，在500W下超声破碎20min，工作2s，间歇6s， 破碎液于4℃和10000rpm下离心10min，重复离心三次后得到上清粗酶液；所述Tris-HCl 缓冲液体积用量以湿菌体重量计为15mL/g；(2)采用Ni-NTA金属螯合亲和层析，取上 清粗酶液上样至预平衡Ni²⁺柱中，再依次用含10mM咪唑、40mM咪唑、100mM咪唑、 250mM咪唑的缓冲液洗脱杂蛋白和目的蛋白，收集含100mM咪唑缓冲液的流出液用 50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液通过超滤浓缩脱盐，所得的脱盐酶液即为重组羰基还原 酶ReCR酶液；所述缓冲液为含300mM氯化钠的pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液，所 述酶用量以酶活力单位计为400～19500U/L反应体系。