[发明专利]一种重组羰基还原酶ReCR、编码基因、载体、工程菌及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种(S)-N-Boc-3-哌啶醇的制备方法，特别涉及一种在两相体系中生 物酶法不对称还原N-Boc-3-哌啶酮制备手性纯(S)-N-Boc-3-哌啶醇的方法。

(二)背景技术

许多药物分子均含有氮杂环结构单元。美国FDA批准的药物数据分析表明，59％ 的小分子药物含有氮杂环，其中最常见的是六元环；在前25种最常用的氮杂环药物 中，排在第一位的是哌啶结构的药物。(S)-N-Boc-3-哌啶醇是一种重要的手性含氮饱 和杂环醇，具有活泼的官能团“-OH”和“-NH-”，是合成多种生物活性物质的重要手性 切块。高抗疟疾活性的天然药物常山碱和异常山碱、神经激肽受体的拮抗剂 L-733,060，以及周期素依赖性激酶的抑制剂夫拉平度都含有(S)-3-哌啶醇结构。此外， (S)-N-Boc-3-哌啶醇还是合成套细胞淋巴癌治疗新药依鲁替尼的中间体。目前所知的 (S)-N-Boc-3-哌啶醇的制备方法主要有化学法不对称合成和选择性拆分，以及生物法 不对称合成。

化学法不对称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇的起始原料多样，可以从L-苹果酸、L-谷 氨酸或L-天冬氨酸等手性酸出发，经缩合、还原等步骤合成，但是步骤繁琐，催化剂 昂贵、反应条件较为严苛。化学法选择性拆分一般是以外消旋的3-哌啶醇经手性樟脑 磺酸CSA或D-酒石酸衍生物(2S,3S)-N-(4-氯苯基)-2,3-二羟基丁酰胺酸的拆分得到 (S)-3-哌啶醇盐类，再解盐加上Boc保护基团，精制得到(S)-N-Boc-3-哌啶醇。化学拆 分的理论收率只有50％，所用的钯碳催化剂昂贵，且后续产物分离比较繁琐。

生物酶法是通过对前手性底物N-Boc-3-哌啶酮的不对称还原得到手性 (S)-N-Boc-3-哌啶醇。最早被用来不对称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇的生物催化剂是野生 胡萝卜组织，但该方法存在催化剂难以大量获得，且产物收率和光学纯度不够高等问 题。最近几年，越来越多的研究发现微生物来源的酶能够将N-Boc-3-哌啶酮不对称还 原成对应的手性醇。酮还原酶或醇脱氢酶以NAD(P)H为辅酶，而辅酶NAD(P)H价格 昂贵，因此利用酮还原酶或醇脱氢酶来不对称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇需要高效的辅 酶循环系统。专利文献(CN103131734A和CN103571908A)公开了在不对称合成 (S)-N-Boc-3-哌啶醇中利用异丙醇作为辅底物进行辅酶再生的方法，然而高浓度异丙 醇对酶存在明显的抑制作用，因而反应的底物浓度不高，反应时间过长。专利文献 (CN104059952A、CN103789368A、CN104603278A)公开了在不对称合成(S)-N-Boc-3- 哌啶醇中利用辅助酶(如葡萄糖脱氢酶或醇脱氢酶)和辅底物(如葡萄糖或醇)进行 辅酶再生的方法。辅助酶葡萄糖脱氢酶催化的反应生成副产物葡萄糖酸，因而需要添 加酸或碱以保持pH恒定的问题；辅助酶醇脱氢酶催化的反应往往是可逆的，因而需 要高浓度的辅底物并且需要较大的辅助酶。不对称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇的工业化 应用，要求适用高浓度的底物，而高浓度的底物和副底物以及生成的高浓度产物均会 抑制酶活力，从而降低催化效率。因此，构建适用于不对称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇 的高效、高光学纯度、高底物浓度的生物酶法具有重要的研究意义和应用价值。

(三)发明内容

本发明目的是利用高效、立体选择性专一的羰基还原酶，提高辅酶循环效率，减 轻高浓度底物、辅助底物及产物对酶活力的抑制，实现生物酶法催化高浓度底物不对 称合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组羰基还原酶ReCR，所述重组羰基还原酶ReCR的氨基酸序 列为SEQIDNO.2所示。

本发明还提供一种所述重组羰基还原酶ReCR编码基因，所述编码基因的核苷酸 序列为SEQIDNO.1所示。