[发明专利]家用智能检测试剂盒

权利要求书

1.家用智能检测试剂盒，其特征在于，是由电子读取分析部分与单克隆抗体检测试剂两大部分构成，所述电子读取分析部分包括单片机系统、光电检测系统、电池、开关K、液晶显示器、复合金标检测探针和试纸；所述单克隆抗体检测试剂包括特异性识别生殖道支原体的单克隆抗体、淋病奈瑟氏菌单克隆抗体、白色念球菌单克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体、复合金标检测探针；

所述试纸包括金标垫、硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫；

所述复合金标检测探针包被在金标垫上，所述复合金标检测探针是由胶体金标记的特异性识别生殖道支原体的单克隆抗体、淋病奈瑟氏菌单克隆抗体、白色念球菌单克隆抗体的复合胶体金-抗体结合物；

所述硝酸纤维素膜上设有检测线1、检测线2、检测线3和对照线4，所述检测线1上包被特异性识别生殖道支原体的单克隆抗体，所述检测线2上包被淋病奈瑟氏菌单克隆抗体，所述检测线3上包被淋白色念球菌单克隆抗体，所述对照线4上包被羊抗鼠IgG抗体；

所述复合金标检测探针的制备方法为：

(1)单克隆抗体的制备：分别用人型支原体和解尿支原体作免疫原产生腹水型支原体单克隆抗体，用淋病奈瑟氏菌作免疫原产生淋病奈瑟氏菌单克隆抗体，用白色念珠菌作免疫原产生白色念球菌单克隆抗体；

(2)胶体金的制备:先将100mL的0.01％HAuCl4溶液加热至沸腾，一次性迅速加入1.4mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热至溶液由淡黄色转变为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，加三蒸水定容至100mL，即得到胶体金溶液；制备的胶体金溶液用透射电镜镜检，确保胶体金颗粒大小一致、均匀，否则重新制备；

(3)复合金标检测探针的制备：用0.1mol/LK₂CO₃调节上述胶体金溶液的pH为9.0，向100mL胶体金溶液中缓慢加入1.2～3.0mg/ml特异性识别生殖道支原体的单克隆抗体、1.2～3.0mg/ml淋病奈瑟氏菌单克隆抗体、1.2～3.0mg/ml白色念球菌单克隆抗体，磁力搅拌器缓慢搅拌1h使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，使得终浓度为1％，2000～4000r/min离心6～10分钟，弃上清液，沉淀用PH5～7檬酸磷酸盐缓冲液稀释至50m，制成抗体金；取抗体金1～20ml加PH5～7檬酸磷酸盐缓冲液稀释到30～60ml，加入微孔板中，-40～-60℃冻干，制成复合胶体金-抗体结合物，即为本发明复合金标检测探针；

所述试纸的制备方法为：

(1)硝酸纤维素膜上检测线的制备：将特异性识别生殖道支原体的单克隆抗体、淋病奈瑟氏菌单克隆抗体、白色念球菌单克隆抗体分别以0.1～3mg/ml的浓度在硝酸纤维素膜上按从左至右的顺序划线，分别为检测线1、检测线2和检测线3，相邻两膜线间的距离为5～6mm，粗细均匀，喷完检测好的膜需立即放入30～40℃烘干10～12小时；

(2)硝酸纤维素膜上质控线的制备：将羊抗鼠IgG抗体按0.1～1mg/ml的浓度在硝酸纤维素膜上划线，该膜线为质控线，位于检测线3的右侧，距离检测线3的距离为5～6mm，粗细均匀，喷完检测好的膜需立即放入30～45℃的烘干10～12小时；

(3)金标垫的制备：用复合金标检测探针溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包含复合胶体金-抗体结合物的金标垫；将金标垫在20～40℃下干燥0.5～1小时；

(4)将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离检测线的一端，将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫上与所述纤维素膜相对的一端，即制成试纸。

2.如权利要求1所述的家用智能检测试剂盒，其特征在于，

所述单克隆抗体选用腹水型支原体单克隆抗体，所述腹水型支原体单克隆抗体的制备步骤如下，

菌种：人型支原体、解尿支原体由美国ATCC公司提供，以上支原体用作免疫原产生单克隆抗体；

细胞株：sp20小鼠骨髓瘤细胞株由第四军医大学细胞工程研究中心提供，作细胞融合用：

免疫原支原体菌株的制备和灭活：分别将人型支原体、解尿支原体液体培养基1ml加到人型支原体、解尿支原体标准菌株冻干粉中，溶解后，分别用移液器吸取支原体菌液分别加到10瓶肺炎支原体液体培养基、10瓶人型支原体液体培养基、10瓶解尿支原体液体培养基，每瓶分别加100μl，经培养成阳性反应后，每种将9瓶置－25℃冰箱作种子保存，一瓶用作二级扩增培养，每瓶扩增成10瓶，呈阳性反应后收获，于4℃冰箱保存，以备用作免疫原菌液；

Balb/C小鼠的免疫：8周龄的Balb/C小鼠20只，分成2组，每组10只，将种作免疫原的支原体菌株的浓度调到10⁵/ml，置50℃恒温箱30分钟灭活，和等量完全佐剂混合后，以每只0.2ml的量，腹腔注射分别免疫Balb/C小鼠；于第一次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次，第31天取脾细胞进行细胞融合；

细胞融合：

(1)免疫脾细胞的制备：

①取免疫小鼠脾脏，放入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于200目的不锈钢网上；用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内不完全培养液轻轻洗钢网，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中；

②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液到30ml，混匀后，经1000rpm离心5分钟，弃去上清；

③用不完全培养液将沉淀细胞再离心、洗涤一次，将沉淀的细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数版计数；总细胞数调为1×10⁸；

(2)sp20骨髓瘤细胞悬液的制备

①将sp20骨髓瘤细胞进行扩增培养；

②将4瓶扩增培养的骨髓瘤细胞收集到50ml的离心管内；

③1000rpm离心5分钟，弃去上清；

④加入30ml不完全培养液，重复步骤③，再离心洗涤一次，然后将细胞垂悬至10ml，混匀，计数；总细胞数调为2×10⁷；

(3)细胞融合

①分别吸取含1×10⁸个脾细胞悬液和2×10⁷个骨髓瘤细胞悬液，加入50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分摇匀；

②1000rpm离心7分钟，弃去上清；

③加50％的融合剂聚乙二醇0.7ml；

④加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用；

⑤800rpm离心7分钟，弃去上清；

⑥加入20ml含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的选择性培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其垂悬并混匀；

⑦将细胞悬液加入辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，在37℃含5％CO₂的孵箱中培养；

(4)抗体阳性孔检测－间接ELISA法

①用已知支原体抗原菌液包被

②加有克隆生长的孔中的培养上清100μl；

③加酶标抗鼠IgG抗体100μl；

④加底物液100μl，室温避光显色10分钟；

⑤判定结果：在酶联免疫检测仪492波长下测定OD值，空白对照调零；若待测控OD值大于或等于阴性对照孔OD值2.1倍，则可判定为阳性孔，孔内生长有阳性克隆；

(5)克隆化－有限稀释法

将96孔板中培养上清被检测为抗体阳性的孔标记出来；用加样器将孔内的杂交瘤细胞反复吹打均匀后计数，然后用有限稀释法进行逐级稀释，再加到96孔板进行培养；观察克隆生长，记录单克隆孔，并及时进行阳性检测；将阳性克隆的细胞转到24孔板培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞瓶中扩大培养；

(6)杂交瘤细胞的冻存

将呈对数生长的杂交瘤细胞收集于离心管，1000rpm离心10分钟，弃去上清，加入1ml冻存液混匀，然后加到冻存管，在－70℃低温冰箱过夜后转入液氮罐长期保存；

(7)腹水型单克隆抗体制备

将冻存的杂交瘤细胞复苏扩增培养，将扩增培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10分钟，收集上清备用；加无血清培养液到沉淀的细胞中，调整细胞数为1×10⁶/ml，每只Balb/C小鼠腹腔注射0.5ml，接种杂交瘤细胞后7天，拉颈脱臼处死小鼠，吸取腹水离心，收集上清即为腹水型单克隆抗体，分装后置－20℃冰箱，冻存备用；

(8)单克隆抗体的鉴定

支原体单克隆抗体筛选到11株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A6、1E3、2F5、2G8、3F8、4A3、4B2、4H5、5D2、5F7、6D3；经效价测定：以上11种腹水型单克隆抗体的效价为1×10^－5；经交叉反应测定3F8、4H5杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体除解尿支原体、人型支原体外不与其它支原体发生交叉反应；以4H5株单克隆抗体细胞株制备的单克隆抗体作为本发明检测用单克隆抗体。