[发明专利]一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法

权利要求书

1.一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法，包括在无菌条件下，进行以 下步骤：

第一步、建立肝脏机械灌注系统，在离体的肝脏、门静脉、 肝下下腔静脉及行门静脉置管并固定，管中注入0.1ml肝素，在 右心房行上腔静脉置管并固定，结扎肝下下腔静脉后，分别将门 静脉置管和上腔静脉置管连接至机械灌注蠕动泵形成闭合环路；

第二步、获得细胞，利用肝脏机械循环灌注系统，依次行肝 脏灌注消化，切取肝脏置于培养皿内，分离去除肝脏包膜，将细 胞悬液经200目滤网滤过，转至离心管后置于旋转摇荡器，将实 验室水浴震荡器设定至37℃、140rpm，震荡10分钟，而后转入 离心机中50G离心1分钟后取上清，再将上清以150G离心8分钟 弃上清，即得富含肝非实质性细胞悬液；

第三步、免疫磁珠分离F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否细胞，先进 行阴选，根据细胞计数结果，加入5ul/10⁷的CD11bFITC，CD11cPE 抗体，4℃孵育15分钟，PBS洗涤一次，同时加入Anti-PE Microbeads和Anti-FITCMicrobeads，4℃孵育15分钟，LS分 选柱行阴选，收集过磁柱后的细胞悬液；

再进行阳选，根据阴选后细胞悬液细胞数量，加入5ul/10⁷的 F4/80APC抗体，4℃孵育15分钟，PBS洗涤一次，加入Anti-APC Microbeads，4℃孵育15分钟，MS分选柱行阳选，收集磁柱中的 细胞，即为F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否细胞。

第四步、纯度检测，取肝脏机械循环灌注后10^5级细胞重悬 于100微升PBS中，加入CD11bFITC、CD11cPE、F4/80APC流 式抗体，4℃避光孵育30-45分钟，PBS洗涤两次，流式细胞仪检 测细胞表型和纯度。

2.根据权利要求1所述分离纯化肝脏枯否细胞的方法，其特征是： 所述第二步中，消化的条件为EMEM4ml/min*10min，0.45％ Pronase4ml/min*15min，0.02％Collagenase4ml/min*8min。

3.根据权利要求1所述分离纯化肝脏枯否细胞的方法，其特征是： 所述第二步中，离心管内含有10μg/ml、40ml的DNase。