[发明专利]一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离纯化细胞的方法，尤其涉及一种分离纯化 肝脏枯否细胞的方法，属于医学技术领域。

背景技术

肝脏的免疫应答反应与肝癌、肝炎病毒感染和慢性肝病肝损伤等 多种肝脏疾病相关，已经得到越来越多的关注和研究。巨噬细胞是人 体重要的免疫细胞，且肝内的枯否细胞对于肝脏本身和全身的免疫应 答都极为重要。肝脏枯否细胞约占肝脏总细胞的15％，全身巨噬细胞 的50％，主要位于肝窦壁，是肠源性病原体在肝内首先接触的细胞， 是肝内重要的固有免疫细胞之一，参与固有免疫反应，还能通过分泌 促炎因子和趋化因子，影响其他免疫细胞，如T细胞、中性粒细胞等 的活化和肝内的聚集，参与影响固有免疫和先天免疫的交互影响，产 生进一步的免疫应答。对枯否细胞的进一步深入的研究，首先必须建 立一种高效的细胞分离纯化方法。1977年首次通过实验分离出鼠类 肝脏枯否细胞，上世纪90年代通过密度梯度离心获得了较高纯度和 活性的鼠肝脏枯否细胞，本世纪初Valatas等人又根据枯否细胞贴壁 的特性，对分离纯化方法作了进一步改进，通过肝脏组织消化处理、 密度梯度离心、密度梯度离心和贴壁选择四步法，使枯否细胞纯度达 95％左右，细胞得率达80-100×10⁶个/肝。但是，密度梯度法设备昂 贵复杂，在未具备条件的实验室难以开展，耗时长，且无法得到所需 特定表型的枯否细胞。综上所述，机械灌注和密度梯度离心法，虽然 可以获得较高纯度和活性的枯否细胞，但存在以下缺点：一，密度梯 度离心法设备较为昂贵，一些实验室不能够满足实验条件；二，分选 时间较长，对细胞活性及后续实验可能存在影响；三，操作较为复杂， 技术掌握较为困难。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种分离纯化 肝脏枯否细胞的方法，满足实验条件，操作简单，耗时短的同时获 得高纯度的肝脏枯否细胞。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种分离纯化肝脏枯 否细胞的方法，包括在无菌条件下进行以下步骤：

第一步、建立肝脏机械灌注系统，在离体的肝脏、门静脉、肝 下下腔静脉及行门静脉置管并固定，管中注入0.1ml肝素，在右心 房行上腔静脉置管并固定，结扎肝下下腔静脉后，分别将门静脉置 管和上腔静脉置管连接至机械灌注蠕动泵形成闭合环路；

第二步、获得细胞，利用肝脏机械循环灌注系统，依次行肝脏 灌注消化，切取肝脏置于培养皿内，分离去除肝脏包膜，将细胞悬 液经200目滤网滤过，转至离心管后置于旋转摇荡器，37℃、140rpm 震荡10分钟，50G离心1分钟后取上清，再150G离心8分钟弃上清， 即得富含肝非实质性细胞悬液；

第三步、免疫磁珠三标两步法分离F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否细 胞，先进行阴选，根据细胞计数结果，加入相应剂量CD11bFITC， CD11cPE抗体，4℃15分钟，PBS洗涤一次，同时加入Anti-PE Microbeads和Anti-FITCMicrobeads，4℃15分钟，LS分选柱行 阴选，收集过磁柱后的细胞悬液；再进行阳选，根据阴选后细胞悬 液细胞数量，加入相应剂量的F4/80APC抗体，4℃15分钟，PBS 洗涤一次，加入Anti-APCMicrobeads，4℃15分钟，MS分选柱行 阳选，收集磁柱中的细胞，即为F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否细胞；

第四步、纯度检测，取肝脏机械循环灌注后10⁵级细胞重悬于 100微升PBS中，加入CD11bFITC、CD11cPE、F4/80APC流式抗体， 4℃避光孵育30-45分钟，PBS洗涤两次，流式细胞仪检测细胞表型 和纯度。

上述方法的所述第二步中，消化的条件为EMEM4ml/min*10min， 0.45％Pronase4ml/min*15min，0.02％Collagenase4ml/min*8min。 离心管内含有10μg/ml、40ml的DNase。