[发明专利]一种表面预成骨种植体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及口腔医学牙齿缺失种植修复材料领域，具体涉及一种表面预成骨种植体及其制备方法。

背景技术

口腔种植是将钛合金或者其他材料制作的人工牙根植入缺失牙齿患者的颌骨内并在其上制作义齿的一种技术。口腔种植能良好地恢复患者的咀嚼功能，越来越受到牙齿缺失患者的欢迎。为了促进种植体骨结合和提高种植的成功率，目前对种植体有很多改性方法。

首先是物理改性，主要指种植体表面结构的改变，物理改性能增加种植体的亲水性和表面积，所形成的表面微粗糙结构有利于种植体表面与骨组织之间形成机械锁合，但物理改性对种植体骨结合的促进作用有限，只适合作为种植体表面改性的基础。

其次是化学改性，主要指改变种植体表面的化学组成成分，将骨仿生材料施加到种植体表面，使种植体具有良好生物相容性进而较好地促进种植体骨结合，但在种植体骨结合之后，化学改性也存在着仿生材料的降解产物可能会对种植体骨结合产生不利影响等缺点。

近年来兴起的种植体生物学改性越来越受到研究者的关注，其主要是通过包裹或者喷涂等方式将特定的细胞、蛋白或小干扰RNA等施加到种植体表面，来改变种植体骨结合的微环境，促进具有成骨作用的细胞增殖分化和骨质分泌，随着研究的进展，人们也认识到进行生物学改性也存在着生物活性物质半衰期较短、费用昂贵等问题。

因而种植体的骨结合有待通过其他途径进行进一步的改进，我们探索利用细胞膜片技术，使用骨质分泌能力和增殖能力都较强的骨肉瘤细胞，对种植体进行表面预成骨形式的生物学改性，以期望更好更便捷地促进种植体骨结合、提升口腔种植成功率。这是一种全新的种植体生物学改性方法，我们通过动物实验验证了表面预成骨种植体对种植体骨结合良好的促进作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表面预成骨种植体及其制备方法，该方法采用组织工程学的方法对口腔种植所用的种植体进行生物学改进，该种植体能够扩大口腔种植的适用范围和提高口腔种植的成功率。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种表面预成骨种植体的制备方法，包括以下步骤：

1）取新鲜离体骨肉瘤组织，去除肉眼可见的血管筋膜，然后剪碎，用胶原酶将组织块消化为单个骨肉瘤细胞，含血清培养基终止消化后，离心取细胞沉淀；

2）用PBS将细胞沉淀重悬后过滤，将滤出液重新离心，吸去离心后的上清液，用DMEM完全培养基重悬细胞沉淀，获得骨肉瘤细胞悬液；

3）将骨肉瘤细胞悬液加入到培养瓶中培养，培养的骨肉瘤细胞每2~3天换液一次，直至细胞融合达80~90%，用胰蛋白酶消化后传代培养；

4）将获得的第3代骨肉瘤细胞培养在含有促细胞外基质分泌因子的DMEM培养基中，使骨肉瘤细胞复层生长形成骨肉瘤细胞膜片；

5）将骨肉瘤细胞膜片按照种植体长度和直径修整后包裹种植体，形成种植体细胞膜片复合体；

6）将种植体细胞膜片复合体放入成骨诱导培养液中在孵箱内进行成骨诱导，并定期换液；

7）待有足够的骨质生成后，从培养液中取出种植体细胞膜片复合体，去除包裹种植体的骨肉瘤细胞膜片，去净残余的骨肉瘤细胞；

8）对获得的表面预成骨种植体进行彻底的清理、消毒、灭菌。

步骤1）是用I型胶原酶在37℃下，消化60min。

步骤2）中采用孔径为100μm的细胞滤网进行过滤。

步骤3）中是将骨肉瘤细胞悬液在37℃、5%CO2浓度及饱和湿度条件下，用含10%FBS的DMEM完全培养基进行培养。

步骤3）中是用0.25%的胰蛋白酶消化后，按1:3的比例进行传代。

步骤4）中是将第3代骨肉瘤细胞生长至融合度为80%时，将促细胞外基质分泌因子加入到培养基中，每两天换液一次，期间每换液一次重新加入促细胞外基质分泌因子，直至形成含有多层骨肉瘤细胞的细胞膜片。

步骤6）中是将获取的种植体细胞膜片复合体放入添加有维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠的成骨诱导培养液内，在温度37℃、5%CO2浓度、饱和湿度的孵箱内静置培养，1周后取出放于37℃恒温振荡器中在5%CO2浓度、饱和湿度条件下再继续培养2周，期间每3天左右换液一次。

步骤7）中是在无菌条件下使用细胞刮刀、双蒸水超声冲洗和细胞裂解液将种植体表面的骨肉瘤细胞彻底去除。

步骤8）中是将清理、干燥过的表面预成骨种植体使用Co60辐照以彻底杀灭细菌、病毒。