[发明专利]一种产谷氨酸的温敏型重组谷氨酸棒状杆菌及其应用

权利要求书

1.一种产谷氨酸的温敏型重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于敲除野生型谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032的UDP-N-烯醇式乙酰葡萄糖胺转移酶基因和UDP-N-乙酰胞壁酸脱氢酶基因，获得温敏型重组菌。

2.如权利要求1所述的一种产谷氨酸的温敏型重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，以C.glutamicum ATCC 13032为出发菌株，通过PCR方法扩增得到murA基因上游同源臂和murB基因下游同源臂，并通过重叠PCR将上下游同源臂重叠，得到重叠片段；将重叠片段用EcoRI和Hind III双酶切，与同样双酶切的表达载体pK18mobsacB连接，构建重组质粒；将重组质粒电转化至菌株C.glutamicum ATCC 13032中；筛选出完成了两次同源重组的重组子，实现murA、murB基因的敲除，获得温敏型重组菌。

3.权利要求1或2所述温敏型重组谷氨酸棒状杆菌的用途，其特征在于，用于发酵生产谷氨酸。

4.一种利用权利要求1或2所述重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将菌体接种到斜面培养基中活化，32℃培养24-36h；

(2)将活化好的菌种接入种子培养基中，32℃，200rpm，培养6-8h；

(3)将培养好的种子按10％接种量接入发酵培养基中，32℃，200rpm发酵培养；

(4)待发酵培养至菌体OD₆₀₀＝12-16时，将发酵温度提高至38.5℃，200rpm培养至总发酵28-32h；

所述斜面培养基的组成为：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，牛肉膏1％，NaCl 0.25％，MgSO₄0.05％，KH₂PO₄ 0.1％，玉米浆2％，琼脂2％；

所述种子培养基的组成为：葡萄糖30g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，MnSO₄ 2mg/L，FeSO₄ 2mg/L，V_B1 0.3mg/L，V_H 0.2mg/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，尿素0.5g/L，Met1g/L；

所述发酵培养基的组成为：葡萄糖8g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.4g/L，V_H 0.35mg/L，V_B10.5mg/L，甜菜碱5g/L，MnSO₄ 30mg/L，FeSO₄ 30mg/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨5g/L。