[发明专利]一种产谷氨酸的温敏型重组谷氨酸棒状杆菌及其应用

说明书

本发明提供一种产谷氨酸的温敏型重组谷氨酸棒状杆菌，是通过改造野生型谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum ATCC 13032)，敲除其基因组中肽聚糖合成途径中的两个关键基因UDP‑N‑烯醇式乙酰葡萄糖胺转移酶基因(murA)和UDP‑N‑乙酰胞壁酸脱氢酶基因(murB)，获得温敏型重组菌，重组菌的谷氨酸产量得到明显提升，在发酵温度提高至38.5℃情况下谷氨酸产量为4‑7g/L。

技术领域

本发明属于基因工程及发酵工程领域，特别涉及利用基因工程技术对谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032进行分子改造，获得产谷氨酸的温敏型重组菌。

背景技术

谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有重要意义。在食品、医药与工业方面有广泛的用途。为了提高谷氨酸产率，谷氨酸生产菌的研究工作中最为突出的是高产谷氨酸菌的选育工作。从自然界分离得到的谷氨酸生产菌野生株，在生产性能方面往往不能满足发酵生产发展的要求。谷氨酸生产菌株具有较大的自然变异能力，通常负变异频率高于正变异频率，结果造成菌种的衰老和菌株活力减退，导致国内谷氨酸生产行业普遍存在着产酸率水平低、糖酸转化率低、成本高、能耗高等瓶颈问题，因此优良生产菌种的选育，一直是谷氨酸发酵工业上的主要研究课题之一。

目前在我国谷氨酸工业生产中，大部分企业使用的菌株为谷氨酸温度敏感突变株，该菌株具有温度敏感的特性，在菌体进入指数生长期时提高培养温度，强制细胞由正常细胞转型为细胞壁合成缺陷的细胞，促进谷氨酸的分泌，从而达到大量合成并积累谷氨酸的目的。该工艺的特点是：(Ⅰ)具有耐生物素、温度敏感的特点，要在较高的温度下才能正常发酵产酸(一般为37℃－40℃)。(Ⅱ)温度转换是影响产酸的关键，温度对谷氨酸发酵具有生产性的影响表明，温度转换后，必须进行适度剩余生长，完成从谷氨酸非积累型细胞向积累型细胞的转变，以保证在富含生物素的培养基中高产谷氨酸。(Ⅲ)生产原料易得，不仅可以利用生物素含量高的原料如糖蜜、薯干等直接进行发酵生产，而且可以利用淀粉质原料。(Ⅳ)发酵工艺趋于简单发酵过程容易控制、谷氨酸产量高、发酵周期短、产酸稳定以及节约能耗，降低成本等。

早在20世纪70年代，日本就有温度敏感型谷氨酸菌的研究报道。国内最早的报道是1985年上海市工业微生物所的孙智凤等对温度敏感型变异株D₀菌的选育及其作用的报道，他们以该菌为出发菌株，经DES和NTG连续诱变处理，选育得到一株优良的温度敏感型NI菌，此菌的生物素适应范围更广(25μg/l－200μg/l)，同时要在较高温度(37℃－40℃)下才能正常发酵产酸。将NI菌用于大米水解糖在6.5m³发酵罐上生产谷氨酸，平均产酸率达5.89％，平均糖酸转化率为47.25％，平均发酵周期为26.5h。2002年陈宁等报道称定向选育出了具有寡霉素抗性、谷氨酸氧肟盐抗性的温度敏感性突变株TMGO106，然后，以该突变株和产酸率高的天津短杆菌TG961为亲株，通过原生质体融合技术，成功地选育出了产酸率高的融合子CN1021，在6m³发酵罐上其谷氨酸产量达14.6％，糖酸转化率达62.8％，并且该菌株系温度敏感型菌株，可用于谷氨酸强制发酵。

由此可见，对于温度敏感型谷氨酸菌株的选育，我国还处于由传统的选育技术(主要是将野生株谷氨酸生产菌进行有目的的定向改造，或采用紫外线等物理诱变因子或亚硝基胍等化学诱变因子进行常规的诱变育种)向DNA重组技术的转变过程，采用基因工程技术进行温敏型谷氨酸菌株的改造还有待进一步与深入。

发明内容

本发明的目的是提供一种产谷氨酸的温敏型重组谷氨酸棒状杆菌，是通过改造野生型谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum ATCC 13032)，敲除其基因组中肽聚糖合成途径中的两个关键基因UDP-N-烯醇式乙酰葡萄糖胺转移酶基因(murA)和UDP-N-乙酰胞壁酸脱氢酶基因(murB)，获得温敏型重组菌，重组菌的谷氨酸产量得到明显提升。

本发明还提供一种利用重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸的方法，具体包括如下步骤：