[发明专利]基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的探针、方法、试剂及其应用

权利要求书

1.一种基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的探针，其特征在 于，包括检测EGFR、KRAS和BRAF基因中一个或多个基因的突变位点的一条或多条探针，所述 探针的核苷酸序列为SEQIDNO:1～SEQIDNO:16所示序列中的一条或多条。

2.如权利要求1所述的基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的 探针，其特征在于，所述SEQIDNO:1～SEQIDNO:16任一所示序列的5’端连接有-(CH₂)_n- poly(T)_m-、-poly(T)_m-或-(CH₂)_n-，其中，n、m为自然数。

3.一种用于单分子靶向测序的样品的制备方法，其特征在于，包括：通过封阻反应在待 测DNA片段的3’端修饰双脱氧核糖核酸，获得3’端修饰有双脱氧核糖核酸的待测DNA片段； 其中，封阻反应中，脱氧核糖核酸与待修饰的DNA片段的摩尔比为1:25～1:200。

4.一种基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的方法，其特征在 于，包括如下步骤：

(i)将靶向引物的5’端连接到基底表面；其中，所述的靶向引物为如权利要求1所述的 探针；

(ii)提供或制备待测模板核酸，其中，所述的待测模板核酸的3’端修饰有带光学检测 标记的双脱氧核糖核酸；将所述待测模板核酸与所述步骤(i)中连接到基底表面上的靶向 引物进行杂交，形成杂交的靶向引物/模板核酸复合物；

(iii)对所述靶向引物/模板核酸复合物进行成像；

(iv)将所述靶向引物/模板核酸复合物、聚合酶以及一种或多种带光学检测标记的核 苷酸混合，通过聚合酶反应将一种或多种带光学检测标记的核苷酸添加至靶向引物链的3’ 端；获得延伸产物；其中，所述带光学检测标记的核苷酸还具有可断裂的基团；

(v)对延伸后的靶向引物/模板核酸复合物进行成像，并结合步骤(iii)中靶向引物/模 板核酸复合物的定位结果，进行图像比对和纠偏，以鉴定模板核酸上的待测核苷酸序列；

(vi)除去延伸产物上带光学检测标记的核苷酸的可断裂的基团：

(vii)重复步骤(iii)至(vi)一次或多次以鉴定所述模板核酸中的1个或多个核苷酸。

5.如权利要求4所述的基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的 方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，所述的提供或制备待测模板核酸的步骤采用如权利要 求3所述的方法制备获得3’端修饰有双脱氧核糖核酸的待测DNA片段。

6.如权利要求4所述的基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的 方法，其特征在于，所述步骤(i)中，当探针为5’端连接有-(CH₂)_n-poly(T)_m-、-poly(T)_m- 或-(CH₂)_n-的SEQIDNO:1～SEQIDNO:16所示序列中的一条或多条时，靶向引物的5’端通 过氨基与基底表面的环氧基连接。

7.一种无创检测基因突变位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：从血液中提取游离 DNA作为模板核酸，然后采用如权利要求4所述的基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/ BRAF基因突变位点的方法对所得模板核酸进行测序。

8.一种检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所 述的基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的探针。

9.一种检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的测序芯片，其特征在于，所述测序芯片上 固定有如权利要求1所述的基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的 探针。

10.如权利要求1所述的基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点 的探针、如权利要求3所述的用于单分子靶向测序的样品的制备方法、如权利要求4所述的 基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的方法、如权利要求7所述无 创检测基因突变位点的方法、如权利要求8所述的检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的试 剂盒或如权利要求9所述的检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的测序芯片在检测EGFR/ KRAS/BRAF基因突变位点中的应用。