[发明专利]基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的探针、方法、试剂及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种基于单分子靶向测序技术检测 EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的探针、方法、试剂及其应用，以及一种无创检测基因突变位 点的方法。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是位于7号染色 体短臂上的原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，是表皮生长因子受体家族(HER)中的4 个成员之一，HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR酪氨酸激酶区域的突变 主要发生在18～21号外显子，其中19和21号外显子突变占总突变的90％。EGFR信号传导的 异常是导致多种肿瘤发生的原因。研究表明，EGFR在多种肿瘤中都有表达，如结直肠癌、乳 腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等。

K-ras基因是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体短臂上，是ras基因家族成 员之一，编码KRAS蛋白。K-ras基因常见的突变位点位于2号外显子的12号密码子和13号密 码子上、3号外显子的6l号密码子，其中有7个突变热点：G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、 G13V/D，占K-ras基因总突变的98％以上。研究表明体细胞K-ras基因突变与多种人类恶性 肿瘤，如肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、胰腺癌、结直肠癌有关，而生殖细胞K-ras基因突变与努 南综合征和心脏-面部-皮肤(cardio-facio-cutaneous，CFC)综合征相关。

BRAF基因是一种原癌基因，定位于7号染色体上，编码丝/苏氨酸特异性激酶。约 90％的BRAF基因突变发生在外显子15的1799位核苷酸上，T突变为A，导致缬氨酸被谷氨酸 取代(V600E)。BRAF基因突变在黑色素瘤、结直肠癌、神经胶质瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌以及 肺癌等肿瘤细胞系中的发生率依次为59％、18％、11％、9％、14％、2％、3％；此外，BRAF V600E在甲状腺乳头状癌中的发生率高达35.8％。BRAF基因突变是晚期及复发性结直肠癌 最重要的预后指标之一，与患者较差的总体生存期密切相关。

目前常见的检测这三个基因突变的方法有Sanger测序法和荧光定量PCR法。 Sanger测序法中，单对引物可检测多个突变，但对多个基因、或同一基因的不同外显子上的 突变位点就需分别进行扩增测序，操作繁琐，并且灵敏度较低约20％，假阴性率较高。荧光 定量PCR法虽然灵敏度高，但每对引物只能检测一种突变，且每种突变需单独建立一个PCR 反应体系，同时检测多个样本多个突变位点操作繁琐。这两种方法对样本的需要量都较大， 不适合同时检测多个基因突变位点。

高通量测序法(NGS)虽然灵敏度高，同时可检测多个突变位点，但其建库流程复 杂，操作繁琐，时间长，成本高。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突 变位点的探针、方法和应用。本发明还提供了一种用于单分子靶向测序的样品的制备方法。

第一方面，本发明提供了一种基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因 突变位点的探针，包括检测EGFR、KRAS和BRAF基因中一个或多个基因的突变位点的一条或 多条探针，所述探针的核苷酸序列为SEQIDNO:1～SEQIDNO:16所示序列中的一条或多 条。

具体地，如SEQIDNO:1～SEQIDNO:16所示探针如下表1所示。

表1.SEQIDNO:1～SEQIDNO:16所示探针