[发明专利]甘露糖接枝三甲基壳聚糖的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法及其应用。所述甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法包括将N,N,N‑三甲基壳聚糖加入到有机溶剂中使其达到溶胀状态，再加入甘露吡喃异硫氰酸苯酯充分反应，通过乙醇洗涤抽滤减压干燥制得N‑甘露糖‑N,N,N‑三甲基壳聚糖。本发明还提供了甘露糖接枝三甲基壳聚糖的制备方法在制备载药微球制剂中的应用。本发明提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法制备条件温和，制备出的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载药微球制剂能靶向树突状细胞，克服黏膜屏障。

技术领域

本发明涉及载药微球技术领域，具体涉及一种甘露糖接枝三甲基壳聚糖的制备方法及其应用。

背景技术

疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。目前市场上使用的疫苗主要为减毒活疫苗，这种疫苗存在毒力逆转、引起不良反应及需要冰箱贮存和转运等问题。而通过重组DNA技术和化学合成抗原与多肽的这一类新一代的疫苗，虽然限制和避免了传统疫苗常有的副作用，但其免疫原性差、在低pH和酶等作用下会发生降解、吸收率低，单独使用无法产生有效的免疫保护反应等问题。因此，开发适用于新一代疫苗的传递系统是非常必要的。

壳聚糖是自然界中唯一存在的碱性多糖，具有生物相容性和生物可降解性，对皮肤和黏膜无刺激，有抗菌、提高巨噬细胞吞噬能力等多种作用。壳聚糖能介导暂时开放紧密连接的细胞，增强蛋白在黏膜表面的吸收，且壳聚糖可刺激免疫细胞增殖细胞因子，壳聚糖微粒被认为是具有前景的疫苗传递系统。三甲基壳聚糖(N-trimetylchitosan,TMCS)是壳聚糖三甲基化季铵衍生物，具有与壳聚糖相似的优点。相较于壳聚糖，TMCS不管在酸性还是在中性、碱性环境中都携正电荷，具有良好的溶解性，能够更好地促进药物吸收；另外对黏膜具有粘附性，能增加药物与黏膜的接触时间。

树突状细胞通常分布于与外界接触的皮肤(黏膜)部位，主要为皮肤和鼻腔、肺、胃与肠的内层，他们被活化时，会移至淋巴组织中与T细胞与B细胞互相作用，以刺激与控制免疫反应，是目前所发现功能最强的专职抗原提呈细胞。树突状细胞可伸展其树枝结构并穿过上皮细胞摄取抗原，而甘露糖受体是树突状细胞膜表面高表达受体，在较短的时间内即可内化大量负载抗原，并诱导免疫应答反应。因此甘露糖受体对抗原的加工、处理和提呈以及效应T细胞的激活过程中扮演着重要角色。所以，如果能够以甘露糖残基修饰疫苗传递系统，则有望选择性提高树突状细胞对疫苗的摄取率、提高靶向效率，降低毒副作用。

发明内容

为了解决上述通过重组DNA技术和化学合成抗原与多肽的疫苗免疫原性差、在低pH和酶等作用下会发生降解、吸收率低的问题，本发明提供一种甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法及其应用，具有制备条件温和，甘露糖接枝三甲基壳聚糖载药微球制剂对树突状细胞靶向性高，能克服黏膜屏障的优点。

本发明提供一种甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法，包括以下步骤：

a、将N,N,N-三甲基壳聚糖加入到有机溶剂中，搅拌并使其成溶胀状态；

b、将甘露吡喃异硫氰酸苯酯作为甘露糖修饰物溶于步骤a中的有机溶剂中，并与N,N,N-三甲基壳聚糖于室温下搅拌反应，制得反应液；

c、将步骤b制得的反应液加入到乙醇中，抽滤；

d、用乙醇洗涤经步骤c抽滤得到的固体，减压干燥，得到N-甘露糖-N,N,N-三甲基壳聚糖，所述N-甘露糖-N,N,N-三甲基壳聚糖即为甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体。

在本发明提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法的一种较佳实施例中，在上述步骤a中所采用的N,N,N-三甲基壳聚糖由分子量为20kDa-1000kDa的壳聚糖制得。

在本发明提供的甘露糖接枝三甲基壳聚糖载体的制备方法的一种较佳实施例中，所述有机溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮中的任意一种或多种组合。