[发明专利]一种细胞特异性分选体系和细胞特异性分选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细胞特异性分选体系和 细胞分选方法。

背景技术

传统的磁珠法细胞分选技术是采用粒径很小的磁珠(如50nm)， 在其表面偶联抗体，该抗体能够与细胞表面特定的抗原特异性结合， 从而使得细胞表面结合大量磁珠，然后通过磁吸的办法将目的细胞与 其他细胞分离开来。在该细胞分选的方法中，当磁珠表面的抗体与细 胞表面的对应抗原结合形成磁珠-抗体-细胞复合体，并利用磁场将磁 珠-抗体-细胞复合体从各种细胞中筛选出来后，磁珠会附着在细胞表 面，不能被解离释放，所筛选出的细胞是一个磁珠-抗体-细胞复合体， 虽然磁珠的粒径很小，但仍然会对细胞的生长、分化等产生一定的影 响，从而会对实验结果造成一定的影响，尤其是涉及到药物的输送与 释放领域。

在此基础上，很多研究针对于磁珠的成分展开，如利用可降解的 生物材料与氧化铁复合，得到磁性分离介质等。这类方法理论上能够 避免磁珠在细胞生长过程中产生的影响，但是实际操作过程中，需要 添加特定的酶或其他试剂促进生物材料的降解、核酸链的断裂，在这 一过程中，新引进的酶或者试剂仍然会对细胞的生长、分化等会产生 一定的影响。

如何能够在获得目的细胞后将载体及酶彻底分离，成为相关领域 研究人员的研究重点。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种新的细胞特异性分选体系和分选 方法，能够利用磁珠对细胞进行筛选，并使得所添加酶或试剂能被完 全回收的情况下，完成目的细胞的分离，避免了酶或其他添加试剂对 细胞污染以及磁珠对细胞的后续影响。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种细胞特异性分选体 系，包括磁珠、核酸酶、核酸链、特异性抗体；所述磁珠表面修饰有 NHS基团或环氧基团；所述核酸酶通过NHS基团或环氧基团与磁珠 链接，形成磁珠-核酸酶复合物；所述核酸链通过NHS基团或环氧 基团与磁珠链接，所述特异性抗体通过交联剂与核酸链连接，形成磁 珠-核酸链-特异性抗体复合物。

所述的核酸链一端修饰有氨基基团(NH₂)，另一端修饰有巯基 基团(SH)；或者两端均修饰有氨基和/或巯基。核酸通过一端的氨 基基团与NHS磁珠偶联。所述核酸酶为限制性内切酶、脱氧核糖核 酸酶I。

所述交联剂为Sulfo-SMCC。

通过交联剂Sulfo-SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷 -1-1羟酸酯)两端的NHS基团和马来酰亚胺基团分别与特异性抗体 的氨基基团和磁珠表面核酸链的巯基基团偶联，从而实现磁珠、核酸 链、特异性抗体之间的偶联，形成磁珠-核酸链-特异性抗体复合物。

本发明还提供一种细胞特异性分选方法，所述方法包括以下步 骤：

1)对磁珠表面进行NHS或环氧基团修饰；

2)将核酸酶通过NHS基团或环氧基团链接到磁珠表面，形成磁 珠-核酸酶复合物；

3)将核酸链通过磁珠上的NHS基团或环氧基团连接到磁珠表面， 形成核酸链-磁珠复合物；

4)将核酸链通过交联剂与特异性抗体偶联，形成磁珠-核酸链 -特异性抗体复合物；

5)在细胞样品中加入磁珠-核酸链-特异性抗体复合物，形成 磁珠-核酸链-特异性抗体-细胞复合物；

6)通过外加磁场的作用，磁吸收集吸附在磁珠表面的目的细胞， 去除非目的细胞；

7)在收集的磁珠与目标细胞复合物的样品中加入磁珠-核酸酶 复合物，剪切核酸链，使目的细胞释放出来；

8)通过外加磁场的作用，去除磁珠-核酸酶复合物和核酸链剪 切后的磁珠，使得细胞与磁珠分离，磁吸后所获得上清液即为目的细 胞悬液。

本发明可同时去除细胞分离磁珠及磁珠-核酸酶复合物，获得高 质量无核酸酶污染的目的细胞悬液。

本发明采用NHS基团或环氧基团修饰磁珠，只需简单地将含伯 氨基或巯基的生物配体溶解于偶联缓冲液中，室温下将样品与经NHS 或环氧基团修饰的磁珠混合1～2h便可将生物配体共价偶联到磁珠 上，具有操作简单、偶联条件温和、生物配体偶联快速高效的优点。

将核酸酶与磁珠链接，可在获得目的细胞后完全去除，避免核酸 酶对细胞生长、分化等影响，从而可以获得高质量的目的细胞悬液。