[发明专利]一种PCR热启动方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种PCR热启动方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)技术是现代生物医学领域的核心技术，在基础研究、生物技术、临床诊断等领域都发挥巨大的作用。之前的研究发现，PCR反应时，除了特异的目的片段被扩增外，非特异扩增反应也常常会发生，严重时甚至抑制特异性扩增反应的发生。对于困难的目的片段，比如高GC含量，容易形成二级结构以及非常长的目的片段的扩增更加容易受到非特异性扩增的影响。因此，采用各种措施提高扩增反应的特异性对于PCR技术成功运用就变得非常关键了。除了改进引物的设计、优化退火温度或在反应液中加入各种添加剂等众所周知的办法来提高特异性退火的效率从而提高扩增反应的特异性外，采用热启动的办法也是非常有效的。早期的研究发现，由于在配制PCR反应液时，即使反应液放置在冰上，残留的聚合酶活性仍然会导致非特异性反应的发生。目前，已有很多的方法用于实现PCR的热启动，比如手动的热启动，使用抗体或其他可抑制聚合酶的活性的亲和配体，对聚合酶进行多种化学修饰，对引物进行化学修饰，对PCR反应的必需底物dNTP进行化学修饰，用定向进化对聚合酶进行改造，使之变得冷敏感，使用单链结合蛋白与聚合酶重组而成融合的聚合酶等等。这些方法，普遍的缺点是成本很高，用于实现热启动的成本大大超出了PCR本身的成本。其次，除了对PCR反应的必需底物dNTP进行化学修饰的方法外，其他方法只对一种酶甚至单一反应(对引物进行化学修饰)有效，因此适用范围很窄。除了普遍的缺点，不同的方法在实际应用方面还有各自的缺点，比如抗体法中用的抗体在运输、反复冻融及长期储存过程中容易失活。化学修饰的办法，无论对酶、对引物还是dNTP进行修饰，往往都要额外的热激活时间。实际上，之前也有少数的研究尝试通过控制自由镁离子的浓度来实现PCR的热启动，至少从表面上看，这一思路非常有吸引力的。目前，现有技术中通过磷酸根、草酸根控制自由镁离子的浓度来实现PCR的热启动。这两种方法都是通过形成镁离子的沉淀，利用沉淀的镁离子复合物在低温时溶解度较低而抑制聚合酶的活性，高温时溶解度较高而提供较多的自由镁离子并激活聚合酶。但这两个原理类似的专利的方法都有重要的缺陷。由于沉淀需要预先形成，但又不能长时间放置以免形成较大的沉淀而影响镁离子的均匀分布，所以这两个专利的方法不仅需要新鲜配制镁离子沉淀物，操作比较繁琐，很难与高通量的PCR反应兼容。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种廉价高效的可减少非特异性扩增的PCR热启动方法。

本发明的技术方案是这样实现的：一种PCR热启动方法，其特征在于：在缓冲液中扩增核酸，所述缓冲液包括20-100mM温度敏感的pH缓冲剂；2.5-50mMpH敏感的镁离子络合剂；2-30mM水溶性镁盐；20-100mM单价盐。

进一步地，所述单价盐包括钠盐，钾盐和铵盐。

进一步地，所述缓冲液包括50mM温度敏感的pH缓冲剂；50mMpH敏感的镁离子络合剂；25mM水溶性镁盐；50mM单价盐。

进一步地，所述pH敏感的镁离子络合剂与水溶性镁盐的摩尔比为1-1.5:1。

进一步地，所述温度敏感的pH缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸，双(2-羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷和1,3-双(三羟甲基)甲基氨基丙烷的一种或多种的混合物。

进一步地，所述温度敏感的pH缓冲剂为在温度上升10℃时，其pKa值下降超过0.15。

进一步地，所述pH敏感的镁离子络合剂为EDTA，EGTA和BTPA的一种或多种的混合物。

进一步地，所述水溶性镁盐为氯化镁，硫酸镁和醋酸镁中的一种或多种的混合物。