[发明专利]一种快速检测猪瘟病毒/猪繁殖与呼吸综合征病毒/猪伪狂犬病毒/猪细小病毒的试剂盒

说明书

本发明涉及一种快速检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)。本试剂盒主要包括RT‑PCR反应液、引物探针混合液、RT‑PCR反应酶系、DEPC H₂O，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。由于本试剂盒通过多种荧光通道分别检测的方式，应用一步法实时荧光PCR反应模式，能准确快速检测并鉴别出猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒，可广泛应用于猪繁殖障碍性疾病临床早期诊断、口岸检验检疫、疫情防控、及科学研究等多个领域。

技术领域

本发明涉及一种快速检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术一管反应即可检测并鉴别出猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的试剂盒。

背景技术

猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是4种主要的引起猪繁殖障碍的传染病病原。在规模化和集约化的大中型猪场中，繁殖障碍性疾病已成为最重要的疫病之一，并给养猪业造成了严重的经济损失。其中CSFV和PRRSV主要损害猪的免疫系统，降低机体的免疫力，从而造成其他病原的混合感染。当猪同时感染上述两种或多种病原体时，疾病的临床症状和病变将明显加重。由于CSFV、PRRSV、PRV和PPV这4种病毒感染后具有相似的临床症状且易混合感染致病，因此给猪繁殖障碍性疾病的诊断带来一定的的困难。因此，建立一种同时快速检测这4种病原体的方法具有重要的应用价值。

在病原学诊断方法中，荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速及高通量等优点，并可以对病原进行定量检测，近年来已被广泛应用于疾病诊断和鉴别诊断方面。鉴于猪繁殖障碍疾病的复杂性，本研究利用4种不同的荧光素分别标记CSFV、PRRSV、PRV和PPV特异性探针建立了一种用于同时检测这4种病原的多重荧光定量PCR方法，为这4种病原的早期及鉴别检测提供了新的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术对CSFV、PRRSV、PPV和PPV四种病毒进行鉴别的试剂盒，利用本试剂盒可以准确区分这四种病毒。

根据Gene Bank中登录的CSFV、PRRSV、PPV和PPV序列，应用DNAMAN软件进行同源性分析，并找出各个病毒的保守区。应用Primer Express3.0软件根据每种病毒基因的保守区基因设计特异性的引物及探针，并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。4条探针的5’端分别用FAM、HEX、CY5和Texas Red标记，以便于在检测中区分。这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反应酶系以及含有Mg²⁺等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。

本发明所涉及的试剂盒主要包括：1)RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O，阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

本发明的一个优选实施方案是引物探针混合液由四种致病性病毒特异性的正、反向引物，特异性的探针组成，其特征在于：