[发明专利]利用PCR技术检测山羊TMEM95基因微小拷贝数变异的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种利用PCR技术检测山羊TMEM 95基因微小拷贝数变异的方法及其应用，该方法以包含TMEM 95基因的中国地方山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增山羊TMEM 95基因部分序列，再对PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊TMEM 95基因非编码区58bp微小拷贝数变异；由于TMEM 95基因对生长性状、泌乳性状具有重要调控作用，故本发明提供的检测方法为TMEM 95基因的微小拷贝数变异与生产性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国山羊生产性状的标记辅助选择，利于建立遗传资源优良的山羊种群。

技术领域

本发明属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及微小拷贝数变异(CNV)的检测，特别涉及一种快速、准确检测山羊跨膜蛋白95(TMEM95)基因58bp微小拷贝数变异(CNV)的方法。

背景技术

拷贝数变异(Copy number variation,CNV)是指由基因组发生重排而导致的与基因组参考序列相比，基因组中出现DNA片段拷贝数的增加、减少、倒位或易位。从狭义的角度来看，拷贝数变化的DNA片段长度一般大于1kb，但从广义的角度来看，拷贝数变化的DNA片段长度一般大于50bp，主要表现为亚显微水平的缺失和重复。拷贝数变异(CNV)是基因组结构变异(Structural variation,SV)的重要组成部分，具有分布范围广、可遗传、相对稳定和高度异质性等特点。在基因组中拷贝数变异(CNV)位点的突变率远高于SNP(Singlenucleotide polymorphism)，其变异引起的基因剂量改变可以导致表型改变。基于以上特点，拷贝数变异(CNV)可以作为一种新的可以预测生产性状的基因组DNA多态性标志。

近几年，拷贝数变异(CNV)全基因组关联分析开始出现，使从基因组结构变异的角度解析复杂性状的分子机制和遗传基础成为可能。在生物医学和动物生产实践中，拷贝数变异的检测及其应用具有重要意义。例如：研究某些重要功能基因拷贝数变异多态性，可阐明机体对疾病、毒物和应激的易感性，为临床医学、遗传病学、预防医学的发展开拓新的研究领域(Balaratnasingam et al.,2015；Riggs et al.,2014；Lee et al.,2012)；研究动物基因组水平的拷贝数变异多态性，并将其与生长性状、泌乳性状、繁殖性状等生产性状进行关联分析，将有利于发现影响生产性状的重要变异，为以标记辅助选择(MAS)技术为基础的分子育种提供基础资料。

2004年，美国冷泉港实验室Sebat等利用代表性寡核苷酸微阵列ROMA(Representational oligonucleotide microarray analysis)技术，分析了20个正常个体的基因组DNA片段的拷贝数情况，结果在76个位点上发现了221个大于100kb的拷贝数变异(CNV)(Sebat et al.2004)。瑞士洛桑大学研究小组Iafrate等使用基于细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)探针的比较基因组杂交微阵列，分析了55例个体的大片段拷贝数变异(CNV)情况，鉴定了255个重复和缺失(Iafrate et al.2004)。这两项拷贝数变异(CNV)领域的开创性研究拓展了人们对人类遗传变异的认识。

随后，大量拷贝数变异(CNV)图谱以及CNVRs(Copy number variation regions)被发现。由于CNVRs包含成百上千的基因，疾病位点，数量性状遗传位点等重要区域，比SNP有更多的核苷酸含量，覆盖的区域更大。因此，在对生物性状的影响上，拷贝数变异(CNV)作为一种重要的新的遗传变异形式，可能具有比SNP更重要的作用。《Nature Genetics》，《Genome Research》等杂志从不同的方面对拷贝数变异(CNV)的研究进行了报告，研究发现在人类基因组上，有至少12％的区域会发生DNA大片段的增多或者丢失，这充分的说明了拷贝数变异(CNV)在基因组中的重要作用。拷贝数变异(CNV)作为一种和SNP互补的重要的基因组遗传变异形式，联合使用SNP和拷贝数变异(CNV)这两种遗传标记在标记辅助育种中有着广阔的应用前景。