[发明专利]一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法

说明书

技术领域

本发明属于一种蛋白复性方法，具体说是一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法。

背景技术

糖尿病是多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，是由于体内胰岛素绝对或相对缺乏或靶组织对胰岛素不敏感而引起的综合病症。近年来，随着人们生活水平的改善，糖尿病的发病率呈现出逐年上升的趋势，成为仅次于心血管和肿瘤的第三大致死疾病，根据国际糖尿病联盟(IDF)公布的数据，2014年全球糖尿病患者数量(20岁至79岁)达到3.87亿人，较去年增加了500万人，预计在2035年将达到5.92亿人。大量的临床实践证实，用重组人胰岛素注射液治疗糖尿病可取得理想的效果。

胰岛素原基因在许多系统如大肠杆菌，酵母，枯草杆菌及链球菌中都得到了表达，目前较多采用的表达系统为大肠杆菌表达系统。然而当外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时常形成不可溶，无活性的聚集体，又称包涵体，包涵体须通过体外复性操作使其形成正确的高级结构才能得到具有预期生物活性的目的蛋白。

目前重组人胰岛素原融合蛋白复性方法主要包括以下几种：

(1)稀释复性：直接加入水或缓冲液进行稀释，之后放置过夜。稀释法主要有：一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式；

(2)透析复性：不增加体积，通过逐渐降低外渗透液浓度来控制变性剂去除。

(3)柱上复性：包涵体经变性后，在色谱柱上复性。

现有蛋白复性方法存在以下技术缺陷：

(1)稀释复性：增加体积较大，变性剂稀释速度太快，不易控制，且复性时蛋白含量较低，一般2mg/mL以下，复性率在60％左右。

(2)透析复性：不适合大规模生产，无法应用到生产规模，且易形成无活性蛋白质具体。

(3)柱上复性：生产工艺复杂，且增加生产成本。

因此开发一种适于工业化生产的重组人胰岛素原融合蛋白复性方法，克服了已有工艺复性后复性蛋白浓度小、蛋白易聚集的缺陷，简化生产工艺的同时，提高蛋白复性率，提高生产效率，满足广大糖尿病患者用药的需求，不仅具有重要的经济意义，而且具有重要的社会意义。

发明内容

发明人经过深入的研究，对大肠杆菌表达重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法进行了改进。经过广泛实验，改进了溶解、还原、复性条件，最终克服了复性时蛋白浓度小、蛋白易聚集沉淀的缺陷，使重组人胰岛素原融合蛋白在较高的浓度下进行复性，简化生产工艺的同时，复性率提高至80％-90％，提高生产效率，适合工业化生产。

因此，本发明所要解决的技术问题是提供一种适于工业化生产的大肠杆菌表达重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法，以克服现有技术中存在的复性时蛋白浓度较低、生产工艺复杂、复性率较低的技术缺陷。

本发明提供一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法，包括以下步骤：

1)将表达重组人胰岛素原融合蛋白的大肠杆菌进行破碎，收集包涵体；

2)使用包涵体洗涤液对于包涵体进行洗涤，所述包涵体洗涤液为含有终浓度10-100mM Tris-HCl、1-10mM EDTA、质量比1-5％Triton-X100、1-5M尿素的溶液，该包涵体洗涤液的pH为8.5-9.5；

3)去除洗涤液后，在包涵体里加入变性剂，所述包涵体变性剂是含有终浓度10-100mM的Tris-HCl、终浓度1-10mM的EDTA、终浓度5-10M的尿素的溶液，该包涵体变性剂的pH为8-9.5；

4)加入还原剂，所述还原剂为巯基还原剂，使用终浓度为5-20mM，获得还原蛋白溶液；

5)将配好的复性缓冲液缓慢加入4)中的还原蛋白溶液中，轻微搅拌，进行重组人胰岛素原融合蛋白的复性，所述复性缓冲液的各组分终浓度分别为0.50-1.50M的尿素、1-10mM的氧化型谷胱甘肽、1-5mM的还原型谷胱甘肽、1-5mM的EDTA、终浓度1-5mM的β-巯基乙醇，调pH8-9.5，得到优化的复性蛋白溶液。

本发明的优点在于表达重组人胰岛素原融合蛋白的大肠杆菌菌体经破碎收集包涵体、洗涤、溶解，先不经纯化，直接进行变复性得到可溶且具有天然结构的重组人胰岛素原融合蛋白。重组人胰岛素原融合蛋白经变性还原后浓度为50～100mg/mL。

本发明还提供了一种复性方法，所述的破碎为机械破碎方法，优选超声破碎、高压菌体破碎或均质机破碎。

本发明还提供了一种复性方法，所述的步骤2)所述包涵体洗涤液为一种配置成终浓度50mM Tris-HCl、2mM EDTA、质量比1％Triton-X100、3M尿素的溶液，其pH调为9.0-9.5。