[发明专利]一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选菌株的方法，特别是涉及一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法，主要是临床分离的金黄色葡萄球菌中能高产α毒素菌株的筛选，属于生物检测领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌是人类重要条件致病菌，引起人和动物的软组织感染、肺炎、菌血症等疾病。金黄色葡萄球菌α-溶血素是金葡菌感染过程中一种重要的毒力因子，在金黄色葡萄球肺炎致病过程中起重要的作用。α毒素是具有良好的抗原性的外毒素，也成为金黄色葡萄球菌疫苗重要的靶点，因此筛选高产a毒素金黄色葡萄球菌菌株为金黄色葡萄球疫苗生产用菌株或相关领域研究用菌株愈显重要。目前，对α毒素的定量主要是利用ELISA方法；对于菌株筛选采用ELISA方法对仪器设备技术要求高，试剂及实验材料成本高、实验重复性差，不利于大规模筛选的应用。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题，给出一种新型筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株的方法。本发明可以特异性检出产生α毒素的金黄色葡萄球菌菌株，亦可通过对比菌株培养滤液对兔血红细胞的溶血活力的强弱，筛选出相对高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株。本方法克服其他溶血试验仅能定性弊端，且操作简单，耐用性好，可用于大规模菌株的筛选。

本发明给出的技术方案是：一种筛选高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株方法，其特征在于有以下步骤：

（1）菌株的复苏和培养

（2）样品制备

（3）溶血反应

（4）溶血记录

（5）判定及结论。

所述步骤（1）菌株的复苏和培养：适当保存形式的临床分离株2株，SA59、SA79、自购菌株CMCC26068、CMCC26002及ATCC?10832?，用营养琼脂斜面复苏（37℃）2代后待用；取菌株斜面培养物用接种环接种至5ml营养肉汤培养基，37℃培养24小时。

所述步骤（2）样品制备：菌株的营养肉汤培养物用0.22μm针头除菌滤器过滤除菌制备α毒素滤液样品。

所述步骤（3）溶血反应：共设9个反应管，分别为溶血组1至5、中和组1、中和组2、阳性对照组、阴性对照组。各反应管加入对应试剂或溶液。室温放置30min后，加入300μl10%兔血红细胞（50%兔血红细胞用无菌生理盐水5倍稀释），置37℃1h，后常温放置1h。

所述步骤（4）溶血记录：用“++++”表示完全溶血（透光程度与阳性对照组一致）、“+++”介于完全溶血与50%溶血之间、“++”表示50%溶血、“+”表示25%溶血、“-”表示未溶血（与阴性对照管一致）。

所述步骤（5）判定及结论：阳性对照组出现完全溶血且阴性对照组不出现溶血，方法过程成立；溶血组管出现完全溶血（++++）、中和组管不出现溶血（-），可说明该菌株产生a毒素；通过对比50%溶血出现的溶血组，可以筛选出a毒素产生能力相对高的菌株。

与现有技术相比较，本发明的有益效果是：通过对比菌株培养滤液对兔血红细胞的溶血活力的强弱，筛选出相对高产α毒素的金黄色葡萄球菌菌株。本方法克服其他溶血试验仅能定性弊端，且操作简单，耐用性好，结果快速，适用于大规模菌株筛选；利用国际标准血清，方便多实验室结果对比。

具体实施方式

实施例1。

材料及材料。

培养基：营养肉汤、营养琼脂斜面。

菌株：临床分离金黄色葡萄球菌菌株SA59、SA79、（中国医科大学附属盛京医院检验科采集）、自购菌株CMCC26068、CMCC26002及ATCC?10832?。

2IU/ml标准血清：2IU/ml金黄色葡萄球菌α毒素国际标准抗血清配制：将抗金黄色葡萄球菌α毒素标准血清（220IU，购自NIBSC）用无菌生理盐水溶解并定容110ml，分装，-40℃保存。

50%兔血红细胞：消毒兔耳中动脉，5ml注射器（含抗凝剂）吸取5ml血液；血液在4℃，1500rpm条件下离心5min。弃上清，用无菌生理盐水洗涤。重复2次后目视细胞层体积，加入等体积无菌生理盐水，即得50%兔血红细胞。4℃保存，12小时内可用。

稀释液：无菌生理盐水（0.9%NaCl溶液）。

实施例2。

菌株的复苏和培养。