[发明专利]完全不动精子的生育力保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种精子生育力保存的方法，尤其是一种完全不动精子的生育力保存方法。

背景技术

目前，精液冷冻保存技术已有200多年的历史。人的精液冷冻保存可以追溯到20世纪 40年代末。精液冷冻保存在我国主要应用于人类精子库以及生育能力的保存。国内外研究者 通过几十年对精液冷冻程序、冷冻稀释液、解冻液等的筛选，已经建立了较为成熟的精液冷 冻保存体系。全国各生殖中心对人精液冷冻保护剂的需求量比较大，而市场上人精液冷冻保 存剂几乎全部被国外的生物公司所垄断，国内只有部分科研院所自行配置畜禽精液冷冻保护 剂。国内还没有自行开发的人类精液冷冻保护剂应用于临床，并且现有的商品化的人类精液 冷冻保存系统适合于人的正常精液，对少弱精的保存效果并不理想。

精子冷冻是保存男性生育力最有效的方法，已成为人类辅助生殖技术(ART)中必不可 少的技术。许多研究表明，来源于射出、附睾穿刺(PESA)和睾丸穿刺(TESA)的精子经 冷冻保存及卵胞浆内单精子注射(ICSI)后能获得与新鲜精子相似的临床结局。传统的观点 认为，精子冷冻保存的前提需要有运动的精子。但是，对于完全不运动的精子是否有冷冻保 存价值尚不清楚。

ICSI技术是目前治疗严重男性不育的理想手段。有报道，应用不运动精子行ICSI后可获 得临床妊娠并生下健康后代，然而，其受精率、胚胎发育潜能明显低于活动精子。进一步研 究证实，不运动精子并不表明其已经死亡，其存活的精子仍具有正常的受精能力。这提示， ICSI的基础是需要有存活的精子。那么，如何快速、准确、高效及安全地鉴别完全不动精子 中的存活状态以确定是否适合冷冻保存及解冻后如何选择存活精子进行受精是关键。WHO第 5版《人类精液检查与处理操作手册》中推荐低渗肿胀试验和伊红染色用于诊断性评估精子 的活力。然而，这两种方法存在不足之处，前者操作较繁琐且不适用于冷冻-解冻的精子，后 者经染色后即使鉴定为存活精子也无法再用于受精。进一步研究发现，应用激光照射精子尾 膜时，存活的精子产生突然的应急反应，精子尾部卷曲，而死精子无这种现象，并且其应用 在新鲜和冻融后的完全不动精子均有相似的现象。进一步研究证明，激光照射精子尾部对精 子头部DNA并无损伤，并且精子尾部在受精过程中没有实质的意义。这提示，激光可能是 一种安全有效地鉴别不动精子存活状态的有效方法。

传统的观点认为，只有运动的精子适合冷冻保存。然而，有些不育患者精子的活动率极 低，甚至所有的精子都完全不运动，多见于精子原纤毛不动症和睾丸手术取精的患者。对于 前者，临床上常规的处理是丢弃射出的完全不动精子，择期改行睾丸穿刺取精尝试寻找活动 精子。对于后者，如果穿刺出来的是完全不动精子也极有可能被废弃，择期再行睾丸穿刺术。 重复穿刺势必增加了患者远期并发症发生的机会和经济负担，因此，如何有效地保存这些患 者生育力是值得深思的问题。

常规的精子冷冻方法使用2ml的冷冻管，精液与冷冻液按1∶1比例稀释后经液氮熏蒸后再 投入液氮冷冻保存。由于冷冻过程中细胞内冰晶形成等因素会导致一定程度的精子损伤，采 用目前传统的冷冻方法冻存稀少精子复苏率及回收率较低，复苏后精子细胞膜损伤严重，导 致无法用于后续的辅助生殖治疗。也有一些报道利用人类和小鼠的空透明带冷冻稀少精子， 但人卵透明带较难获得，且可能存在污染的问题，难以推广应用。冷冻环也有被应用于稀少 精子冷冻，但精子加载难度较大。临床上，往往有些患者获取的精子活力甚微，甚至完全不 动。因此，需迫切寻求一种稳定、高效的冷冻完全不动精子症患者生育力的方法。

理论基础：

精子膜完整性与精子代谢、顶体反应、精子获能及精卵融合密切相关。此外，精子膜功 能完整性还与受精卵着床、胚胎植入密切相关。精子尾部细胞膜属于半透膜，具有自动调节 膜内外渗透压平衡的能力。激光具有热效应，当低能量激光射击活动精子尾部时，由于局部 温度升高很可能发生蛋白质变性而导致精子尾部细胞膜的流动性、通透性改变。当激光照射 精子尾膜时，热效应使精子尾膜内外的渗透压不平衡，活精子的细胞膜处于完整的状态，具 备调节细胞膜内外渗透压平衡的能力，水分子可由膜外进入膜内；而死精子尾膜的通透性发 生改变，丧失调节膜内外渗透压的能力，水分子无法进入膜内。激光的这一特性为胚胎学家 从完全不动精子中鉴别有活力精子用于ICSI提供了新思路。