[发明专利]一种以棉花幼胚为受体接种TRV病毒诱导基因沉默方法

权利要求书

1.一种以棉花幼胚为受体的TRV病毒诱导棉花基因沉默的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将目的基因插入TRV病毒载体中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后的农杆菌；

(2)取棉花种子，经脱绒、灭菌后，经萌发后去除萌发种子的内、外皮，幼胚放入含有2.5～3.5mg/LGA3(赤霉素)的MS液体培养基中，25～30℃，120rpm/min暗培养6～10h，制得待侵染胚；

(3)培养步骤(1)制得的转化后的农杆菌，制得农杆菌侵染液，然后加入农杆菌侵染液质量百分比0.15～0.25％的表面活性剂，制得侵染液，将步骤(2)制得的待侵染胚浸入侵染液中，22～28℃，100～150rpm/min，暗培养20～40分钟，去除多余侵染液，经共培养后，栽种到灭菌的营养土中，进行营养土培养，即可。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的目的基因为棉花GhCLA1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的重组载体，为将目的基因用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切后，连接入同样经限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切后的TRV病毒载体中。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的转化为冻融法转化。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的病毒载体TRV载体系统，包含TRV1和TRV2载体；农杆菌为农杆菌GV3101。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中脱绒为采用浓硫酸脱绒，灭菌为采用质量浓度为15％的双氧水浸泡0.5～1.5h。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中萌发为在灭菌水中25～30℃浸泡15～18h。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中农杆菌侵染液的制备步骤如下：

将转化后的农杆菌涂布在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平的LB固体培养基上，25～30℃暗培养2～3天；挑取单克隆接入含有相同浓度抗生素的LB液体培养基中，25～30℃振荡过夜培养，制得液体培养物；

取1mL液体培养物扩繁至100mL含有上述相同浓度抗生素且含有10mM的MES和20μM乙酰丁香酮的LB液体培养基中，25～30℃过夜培养；25℃，4500rpm离心菌体，将菌体重悬在含有10mM MgCl₂，10mM 2-(N-吗啉)乙磺酸，200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基中，调整OD₆₀₀＝1.5，22～28℃，暗处理2.5～3h，制得农杆菌侵染液。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中表面活性剂为SilwetL-77。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中共培养为在共培养培养基中于22～28℃暗培养2～3天；共培养培养基为含有200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述含有200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基为将200μM乙酰丁香酮的MS液体培养基浸润4～7层滤纸制得。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中营养土培养为将生根后的幼苗在22～25℃，14h光照/10h黑暗的条件下，于营养土中培养，即可。