[发明专利]一种以棉花幼胚为受体接种TRV病毒诱导基因沉默方法

说明书

本发明涉及一种以棉花幼胚为受体接种TRV病毒诱导内源基因沉默的方法，步骤如下：(1)将目的基因插入TRV病毒载体中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后的农杆菌；(2)取棉花种子，经脱绒、灭菌后，经萌发后去除萌发种子的内、外皮，幼胚放入含有赤霉素的MS液体培养基中，制得待侵染胚；(3)培养转化后的农杆菌，制得农杆菌侵染液，制得侵染液，将待侵染胚浸入侵染液中，暗培养，经共培养后，栽种到灭菌的营养土中，进行营养土培养，即可。本发明首次以棉花幼胚作为受体接种TRV病毒，不对幼胚进行破坏性处理，不产生任何损伤，克服了接种病毒时对棉苗造成机械损伤的缺点。

技术领域

本发明涉及一种以棉花幼胚为受体接种TRV病毒诱导内源基因沉默的方法，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

陆地棉全基因组测序已完成，产生海量DNA序列信息，深入研究这些序列的功能尤为迫切。传统的基因功能研究手段主要以遗传转化为基础，但棉花的转化效率低，转化过程繁琐且对受体基因型的依赖性较强，严重限制棉花功能基因组研究的发展。

病毒介导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)是一种快速、高效、高通量的反向遗传学技术，其原理是利用重组病毒抑制植物内源基因的表达，通过表型及生理数据的分析鉴定基因功能。VIGS技术克服传统研究方法需要依赖遗传转化的局限性，近几年在棉花基因功能研究中得到广泛应用。其中，烟草脆裂病毒(tobacco rattlevirus，TRV)载体是棉花中应用最为广泛VIGS载体。虽然VIGS沉默起效快、效率高，但该技术在具体实验操作中的不足之处亦很明显，如接种病毒的方式多利用注射器渗透子叶或摩擦破坏叶表皮接种，对棉苗造成损伤；接种时间一般在子叶完全平展后，因此，不能用来研究发育较早期的基因功能；接种病毒时所需农杆菌侵染液制备量大，实验成本高；接种过程耗时长等。对VIGS技术体系中的不足之处进行改良，可使该技术在棉花基因功能研究中发挥更大作用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种无损伤、沉默时间更早、成本更低、操作更简便的转化方法，即以棉花幼胚为受体的TRV病毒诱导基因沉默的方法。

一种以棉花幼胚为受体的TRV病毒诱导基因沉默的方法，步骤如下：

(1)将目的基因插入TRV病毒载体中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后的农杆菌；

(2)取棉花种子，经脱绒、灭菌后，经萌发后去除萌发种子的内、外皮，幼胚放入含有2.5～3.5mg/L GA3(赤霉素)的MS液体培养基中，25～30℃，120rpm/min暗培养6～10h，制得待侵染胚；

(3)培养步骤(1)制得的转化后的农杆菌，制得农杆菌侵染液，然后加入农杆菌侵染液质量百分比0.15～0.25％的表面活性剂，制得侵染液，将步骤(2)制得的待侵染胚浸入侵染液中，22～28℃，100～150rpm/min，暗培养20～40分钟，去除多余侵染液，经共培养后，栽种到灭菌的营养土中，进行营养土培养，即可。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的目的基因为棉花GhCLA1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的重组载体，为将目的基因用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切后，连接入同样经限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切后的TRV病毒载体中。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的转化为冻融法转化。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的病毒载体TRV载体系统，包含TRV1和TRV2载体；农杆菌为GV3101。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中脱绒为采用浓硫酸脱绒，灭菌为采用质量浓度为15％的双氧水浸泡0.5～1.5h，然后用大量的无菌水冲洗。