[发明专利]高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法

权利要求书

1.高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以 下步骤进行：

一、敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建；

二、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建：

以敲除了ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01基因组DNA为模板，分别用 ack-L₁、ack-L₂和ack-R₁、ack-R₂引物进行PCR反应；

三、pack-L和pack-R质粒构建：

向含有ack基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μLTaq5U/μL的 DNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ack-L和ack-R，将片 段ack-L和ack-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pack-L和pack-R；

四、pack-LR质粒构建：

以pack-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和BglII对质粒载体pldh-L进行双酶切，选 用限制性内切酶XhoI和BamHI对质粒载体pack-R进行双酶切，用T4DNA连接酶将pack-R 的酶切产物连接到pack-L质粒载体上，得到重组质粒pack-LR；

五、pT-Kan^r质粒构建：

以pET-28a(+)为模板，利用Kan-up和Kan-down为扩增引物，对Kan^r进行PCR扩增，对PCR 产物进行TA克隆，得到pT-Kan^r质粒；

六、同源重组片段ackL-Kan^r-ackR的构建：

以重组质粒pack-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Kan^r和pack-LR进 行酶切，将获得的Kan^r片段插入质粒载体pack-LR中，构建质粒载体pT-LKR；

选择限制性内切酶BglII和BamHI对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段 ackL-Kan^r-ackR；

七、K.oxytocaHD79-01/pKD46菌株构建：

将质粒pKD46电转化到K.oxytocaHD79-01感受态细胞，得到K.oxytocaHD79-01/ pKD46菌株；

八、同源重组片段ackL-Kan^r-ackR转化K.oxytocaHD79-01/pKD46：

将同源重组片段ackL-Kan^r-ackR电转化到K.oxytocaHD79-01/pKD46中，得到的目的菌 株为高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-02。