[发明专利]高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产2,3-丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。

背景技术

产酸克雷伯氏菌(Klebisellaoxytoca)作为2,3-丁二醇的产生菌，具有适应环境 能力强、底物范围广、代谢彻底、副产物较少、产物浓度和转化率较高等优点被认为是工业 化生产的潜在菌株。但是，酸性副产物乳酸的积累仍是限制2,3-丁二醇产量提高的主要因 素，发酵过程中乳酸含量的增加，会抑制菌体的生长，不但降低了2,3-丁二醇的产量，同时 增加了后续对2,3-丁二醇分离纯化的复杂性。

另外，还存在2,3-丁二醇转化率低、生产强度低及纯度低的技术问题。

发明内容

本发明是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3-丁二醇产量低、转化率低、生产强 度低及纯度低的问题，提供高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其 发酵方法。

本发明高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进 行：

一、敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建：

二、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建：

以敲除了ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01基因组DNA为模板，分别 用ack-L₁、ack-L₂和ack-R₁、ack-R₂引物进行PCR反应；

三、pack-L和pack-R质粒构建：

向含有ack基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μLTaq(5U/μ L)DNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ack-L和ack-R，将 片段ack-L和ack-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pack-L和pack-R；

四、pack-LR质粒构建；

以pack-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和BglII对质粒载体pldh-L进行双酶 切，选用限制性内切酶XhoI和BamHI对质粒载体pack-R进行双酶切，用T4DNA连接酶将 pack-R的酶切产物连接到pack-L质粒载体上，得到重组质粒pack-LR；

五、pT-Kan^r质粒构建：

以pET-28a(+)为模板，利用Kan-up和Kan-down为扩增引物，对Kan^r进行PCR扩增， 对PCR产物进行TA克隆，得到pT-Kan^r质粒；

六、同源重组片段ackL-Kan^r-ackR的构建：

以重组质粒pack-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Kan^r和pack- LR进行酶切，将获得的Kan^r片段插入质粒载体pack-LR中，构建质粒载体pT-LKR；

选择限制性内切酶BglII和BamHI对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片 段ackL-Kan^r-ackR；

七、K.oxytocaHD79-01/pKD46菌株构建：

将质粒pKD46电转化到K.oxytocaHD79-01感受态细胞，得到K.oxytocaHD79-01/ pKD46菌株；

八、同源重组片段ackL-Kan^r-ackR转化K.oxytocaHD79-01/pKD46：

将同源重组片段ackL-Kan^r-ackR电转化到K.oxytocaHD79-01/pKD46中，得到的 目的菌株为高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-02。

步骤一所述产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)HD79已在文献《Klebisellaoxytoca HD79乙酸激酶部分基因(ack)的克隆与序列分析》(中国农学通报，2015。31(14):83-88)中 公开。

上述方法构建的产酸克雷伯氏基因工程菌株的发酵方法，按以下步骤进行：