[发明专利]利用竹节参细胞大规模培养和生物转化技术获得竹节参皂苷等次生代谢产物的方法

权利要求书

1.一种利用竹节参细胞，通过工业化培养和生物转化技术，生产含竹节参皂苷、三七皂苷和人参皂苷的皂苷类提取物的方法；其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)在RW培养基中添加植物生长素和植物细胞分裂素、选自蔗糖和葡萄糖中的一种或两种，以及凝固剂，经高温消毒并冷却后制备成斜面诱导培养基；高温消毒的参数为115～120℃，0.1～0.15MPa压力下持续10～25分钟；

(2)将竹节参幼茎或幼芽经过表面杀菌后，切成0.5～1cm茎段或取其茎尖作为外植体，接种在步骤(1)的所述斜面诱导培养基上，经过培养形成愈伤组织；表面杀菌处理方法为用70～75体积％乙醇杀菌30～60秒，再用5～7质量％次氯酸盐溶液处理15～25分钟，然后用无菌水冲洗二～三次后备用；

(3)在RW培养基中添加植物细胞分裂素和植物生长素、蔗糖和凝固剂，经高温消毒后制备成平板驯化培养基；高温消毒参数与所述步骤(1)的参数相同；其中步骤(3)中平板驯化培养基的制备如下：在RW培养基中，添加0.1～5mg/L植物生长素和0.1～5mg/L植物细胞分裂素、20～50g/L蔗糖、5～8g/L琼脂或1.8～2.5g/L结冷胶作为凝固剂，经115～120℃，0.1～0.15MPa压力下消毒15～18分钟后经冷却制成；

(4)将在步骤(2)诱导形成的竹节参愈伤组织接种在驯化培养基上进行多次继代培养后，筛选出生长速度较快，质地疏松的高产细胞团；

(5)在RW培养基中添加植物生长素和植物细胞分裂素、蔗糖，后经高温消毒制备出液体培养基；高温消毒参数与步骤(1)相同；其中步骤(5)的所述液体培养基的制备如下：在RW培养基中，添加蔗糖20～40g/L，植物生长素0.1～3mg/L和植物细胞分裂素0.1～3mg/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，在115～120℃，0.1MPa压力下消毒15～18分钟后经冷却制成液体培养基；

(6)将步骤(4)筛选到的高产细胞团接种在步骤(5)的液体培养基中进行2～3周的悬浮培养，摇床转速为100～120转/分；

(7)在与步骤(5)相同的液体培养基中加入凝固剂，经高温消毒后冷却制成平板培养基；高温消毒条件与步骤(1)相同；

(8)用无菌移液管将步骤(6)培养的单细胞分散接种在步骤(7)的平板培养基上培养4～5周；

(9)从步骤(8)的平板培养基上筛选生长速度较快、细胞团较大的细胞团筛选出来作为高产细胞株；

(10)制备出与步骤(5)相同的液体培养基分注到摇瓶或生物反应器中，并将在步骤(9)中筛选出的高产细胞株接种在该培养液中进行悬浮培养，在培养条件为20～25℃，黑暗条件下培养3～4周后，获得高活力扩增细胞，其中所述摇床或生物反应器的转速为80～120转/分；

(11)在步骤(10)的培养液中，在无菌条件下加入含茉莉酮酸甲酯、过氧化氢和水杨酸的组合诱导子以及含选自丙酮酸钠、乙酰辅酶A和甲羟戊酸中的一种或多种的组合前体，进行生物转化与合成培养5～10天；其中在步骤(11)中，所述组合诱导子包括茉莉酮酸甲酯0.1～2mg/L，过氧化氢20～80μl/L，和水杨酸20～90mg/L，所述组合前体包括丙酮酸钠40～80mg/L、乙酰辅酶A1～5mg/L和甲羟戊酸20～40mg/L中的一种或多种；

(12)收集培养液和细胞，从中提取含竹节参皂苷、三七皂苷和人参皂苷的皂苷类提取物。

2.权利要求1的方法，其中步骤(1)的斜面诱导培养基通过在RW培养基中，添加0.1～10mg/L植物生长素和0.1～10mg/L植物细胞分裂素、20～50g/L选自蔗糖和葡萄糖中的一种或两种、5～8g/L琼脂或1.8～2.5g/L结冷胶作为凝固剂，再经115～120℃，0.1～0.15MPa压力下消毒10～25分钟后经冷却制成。

3.权利要求1的方法，其中步骤(2)的竹节参愈伤组织通过将竹节参幼茎或幼芽作为外植体经70～75体积％乙醇表面杀菌30～60秒，再转入5～7质量％的次氯酸钠或次氯酸钙溶液中杀菌15～25分钟，然后用无菌水冲洗二～三次，在无菌条件下，将表面杀菌后的茎尖切下来，或将其幼茎切成0.5～1cm茎段接种到上述步骤(1)的斜面诱导培养基中，之后转移到18～25℃，2000-3000Lux、12～16小时照光条件下进行诱导培养，1～2个月后形成愈伤组织。