[发明专利]利用竹节参细胞大规模培养和生物转化技术获得竹节参皂苷等次生代谢产物的方法

说明书

本发明涉及植物细胞培养领域，提供了利用竹节参细胞大规模培养和生物转化技术获得竹节参皂苷等次生代谢产物的方法，该方法包括：(1)在RW培养基中添加植物生长素和植物细胞分裂素以及凝固剂；(2)将竹节参的外植体表面杀菌并诱导形成愈伤组织；(3)将竹节参愈伤组织进行继代培养，获得疏松细胞团；(4)制备培养液；(5)将疏松细胞团转移到培养液中进行培养；(6)培养并筛选出高产细胞株；(7)将高产细胞株进行扩增培养；(8)制备合成培养基；(9)将细胞在合成培养液中继续培养，完成生物转化；(10)溶剂萃取后纯化。本发明提供的方法可以生产出竹节参的次生代谢产物，生产成本低，培养周期短，不受自然环境限制，可以实现周年生产。

技术领域

本发明涉及一种获得竹节参次生代谢产物的方法，特别是涉及一种利用竹节参细胞大规模培养和生物转化技术获得竹节参皂苷等化合物的方法。

背景技术

竹节参(Panax japonicus C.A.Mey)又名竹节人参或白三七，是五加科人参属植物。俗称“草药王”。主要分布于我国江西、湖北、广西、四川、贵州、云南、西藏等省区的高山灌木丛下，阴湿地或岩石沟涧旁边。它有许多的异名，《中药大辞典》上就说：不同的书籍中有不同的称谓，如：土参、土精、血参(《花镜》)，甜七、竹节七(《草本便方》)，竹节参(《科学的民间药草》)，竹鞭三七、罗汉三七(《中国药植志》)，竹节七、竹七(《中药形性经验鉴别法》)，萝卜七、白三七(《中药材品种论述》)，水三七(《贵州草药》)，明七、野三七、鸡头七(《云南经济植物》)，这种种纷杂的异称，足见竹节参在中药药用中的历史和地位。民间用于滋补强壮，散瘀止痛，止血等。对于竹节参的作用早有记载，如：《草本便方》中有云：“散血活血破血，治痈肿，疗犬伤，金刀，跌扑……”近年来又由于有报道证实竹节参皂大甙具有扩张冠状动脉、降低心肌氧耗作用。同时发现竹节参皂甙能使小鼠心肌细胞内CAMP/CGMP比值明显升高，此作用与其增强心力，扩张冠状动脉有关；此外，还发现竹节参皂苷具有良好的止痛、消肿、生肌、抗缺氧、抗氧化、抗辐射等各种药物活性，其药用价值潜力巨大，成为研究热点。

竹节参的生长缓慢，每年生1节，生物量极为有限，作为药用的野生竹节参一般在5年～数十年生不等。据统计我国的竹节参储量只有2吨左右，属于珍稀名贵药材，目前只是在湖北山区和川西南山区被当地医生有条件使用，在各大城市医院和药店不见销售。虽然在江西、湖南、湖北等地有人进行人工栽培，但是由于其生长量有限，且繁殖困难，又易受病虫害的困扰，长期以来很难实现大面积人工栽培。因此利用生物技术大规模生产其替代产品，并且开发成治疗心脑血管疾病的特效新药具有重要的经济价值和社会价值。

为此我们所经过数年研究开发出了一套为了将竹节参的自然生产方式转变为工业化生产方式的新技术。该技术的应用可以大幅度减少人们对野生资源的采摘和依赖，同时可以大量获得人们所需求的竹节参制品。为人们对于竹节参的药用价值进行深入研究奠定物质基础，为广大患者提供更优良的廉价药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种在不破坏自然资源的条件下，利用生物工程技术获得竹节参皂苷等次生代谢产物的方法。

通过本发明的方法提取到的含竹节参皂苷、三七皂苷和人参皂苷的皂苷类提取物，其中有效成分竹节参皂苷的含量是天然竹节参通过相同提取方法得到的相应提取物的5-10倍。

本发明的技术方案是.一种利用竹节参细胞，通过工业化培养和生物转化技术，生产含竹节参皂苷、三七皂苷和人参皂苷的方法；

其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)在RW培养基中添加植物生长素和植物细胞分裂素、选自蔗糖和葡萄糖中的一种或两种，以及凝固剂，经高温消毒并冷却后制备成斜面诱导培养基；高温消毒的参数为115～120℃，0.1～0.15MPa压力下持续10～25分钟；