[发明专利]一种获得人类甲胎蛋白的方法

权利要求书

1.一种获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：把人类甲胎蛋白全长基因克隆到昆虫细胞表达载体,转化DH10Bac后，获得含有人类甲胎蛋白基因的Bacmid；把Bacmid转染昆虫细胞后，把培养转染昆虫细胞的培养基浓缩纯化获得人类甲胎蛋白。

2.如权利要求1所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)重组AFP/Bac质粒的获得

a、把人类甲胎蛋白全长基因克隆到昆虫细胞表达载体pFastBac1、pFastBacDual或pFastBac1-Gus中，转化DH5α细胞后提取质粒；

b、把连接好的质粒转化DH10Bac细胞，并涂在含有卡那霉素，庆大霉素、四环素、IPGT及X-gal组合的LB培养基平板上，培养10～12h后提取重组AFP/Bac质粒；

(2)表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒的获得

a、溶液A：把5～20μL重组AFP/Bac质粒添加到80～100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，混匀；

b、溶液B：把8～16μL脂质体CellfectinⅡ添加到80～100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，混匀；

c、溶液C：把溶液B加入到溶液A中混合，在室温孵育30～45min；加入1～3mLSFX-Insect昆虫细胞培养基到溶液B与溶液A的混合液中，混匀，获得溶液C；

d、将溶液C滴到昆虫细胞表面，25～30℃培养3～6h，弃去溶液C，向昆虫细胞中加入6～10mL含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基，25～30℃潮湿条件抚育7～9d后，获得表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒；

(3)人类甲胎蛋白的在昆虫细胞中的表达

将表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒按体积比1：50～200接种到昆虫细胞中，悬浮培养48～96h后，收集培养基，把培养基过镍柱和凝胶柱纯化，即可得到人类甲胎蛋白。

3.如权利要求2所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：所述昆虫细胞为Sf9昆虫细胞或Sf21昆虫细胞。

4.如权利要求2所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：所述含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基中，双抗与SFX-Insect昆虫细胞培养基的体积比为1：100。

5.如权利要求2所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的卡那霉素，庆大霉素、四环素、IPGT及X-gal五个成分按体积比1:1.5:2:1:4组成混合溶液，混合溶液按体积比1:1000添加到LB培养基中。

6.如权利要求1所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：获得的表达蛋白分子量为65-75KD，与从人胚胎血提取的甲胎蛋白活性类似度为96％～98％。

7.如权利要求1所述的获得人类甲胎蛋白的方法，其特征在于：获得的表达蛋白可以应用于甲胎蛋白的结晶及结构解析，及人类甲胎蛋白与其他蛋白的体外相互作用。