[发明专利]一种获得人类甲胎蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因工程及蛋白质工程，尤其涉及一种获得人类甲胎蛋白的方法。

背景技术

甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)是肝癌发生时早期表达的特异性蛋白质，70～80％肝癌病人在发病期间都有AFP基因高表达的特征。AFP基因在胎儿发育过程开放表达，而在人出生两年后基本处于关闭状态，但是成人发生肝癌时，AFP的基因重新被激活而大量表达，因而AFP被用作诊断肝癌的金标准，AFP在临床上认为是肝癌的经典肿瘤标记物。

AFP与人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin，HSA)的序列相似率为60％，虽然，这两个蛋白的序列相似率很高，但它们的功能完全不同。HSA是血液系统的重要组分，具有结合和运输内源性及外源性物质等生理功能，而AFP具有运输一些类固醇类、脂肪酸类等的功能外，还有促进细胞生长，抑制机体的免疫应答等功能。近二十年来，多个血清白蛋白结构已被解析，但AFP结构一直没被解析。AFP是人类发现的第一个具有临床应用价值的肿瘤标志物，AFP晶体结构的未解析，很大程度上阻碍人们了解AFP的致癌机理及开发抗肝癌药物。

目前，经检索尚未见关于从人体以外途径获得人类甲胎蛋白方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种获得人类甲胎蛋白的方法，利用昆虫细胞真核表达系统表达人类甲胎蛋白，该表达的人类甲胎蛋白活性较好，可以用于甲胎蛋白的结晶及结构解析，及人类甲胎蛋白与其他蛋白的体外相互作用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种获得人类甲胎蛋白的方法，其中：把人类甲胎蛋白全长基因克隆到昆虫细胞表达载体,转化DH10Bac后，获得含有人类甲胎蛋白基因的Bacmid；把Bacmid转染昆虫细胞后，把培养转染昆虫细胞的培养基浓缩纯化获得人类甲胎蛋白。

本发明获得人类甲胎蛋白的方法，具体包括以下步骤：

(1)重组AFP/Bac质粒的获得：

a、根据人类甲胎蛋白全长基因(GenBank:NM_001134)，在其N端加上XbaI酶切位点，C端加上6×His标签和XhoI酶切位点，具体合成的AFP基因如序列表中SEQIDNO:1所示；把合成基因用XbaI和XhoI双酶切，用T4DNA连接酶连接到昆虫表达载体pFastBac1或pFastBacDual(Invitrogen)或pFastBac1-Gus中，转化DH5α细胞后提取质粒验证。图1中，第三泳道是连接好的pFastBac1-AFP质粒，第二泳道用XbaI和XhoI双酶切验证，2000bp处有AFP大小的片段，说明连接正确；

b、把连接好的质粒转化DH10Bac细胞，并涂在含有卡那霉素，庆大霉素、四环素、IPGT及X-gal组合的LB培养基平板上，培养10～12h后提取重组AFP/Bac质粒；图1中第四泳道是获得重组AFP/Bac质粒；

(2)表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒的获得：

a、溶液A：把5～20μL重组AFP/Bac质粒添加到80～100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基(HyClone)中，混匀；

b、溶液B：把8～16μL脂质体CellfectinⅡ(Invitrogen)添加到80～100μL的SFX-Insect昆虫细胞培养基(HyClone)中，混匀；

c、溶液C：把溶液B加入到溶液A中混合，在室温孵育30～45min；加入1～3mLSFX-Insect昆虫细胞培养基到溶液B与溶液A的混合液中，混匀，获得溶液C；

d、将溶液C滴到昆虫细胞表面，25～30℃培养3～6h，弃去溶液C，向昆虫细胞中加入6～10mL含双抗的SFX-Insect昆虫细胞培养基(SFX-Insect培养基为HyClone公司产品；双抗为碧云天公司产品)，25～30℃潮湿条件孵育7～9d后，获得表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒；

(3)人类甲胎蛋白的在昆虫细胞中的表达

将表达人类甲胎蛋白的昆虫杆状病毒按体积比1：50～200接种到昆虫细胞中，悬浮培养48～96h后，收集培养基，把培养基过镍柱和凝胶柱(superdex200)纯化，即可得到人类甲胎蛋白。

(4)表达人类的甲胎蛋白能促进细胞增殖