[发明专利]用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的引物组、试剂盒和方法

权利要求书

1.用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的引物组，其特征在于，包括以下引 物：

用于扩增COI基因的引物对，由具有SEQIDNO.1所示序列的引物COIF：5’- CTACAATCCACCGCCTAA-3’以及具有SEQIDNO.2所示序列的引物COIR：5’- TAGAAGAAAGTGACAGAGCG-3’组成；

用于扩增ITS序列的引物对，由具有SEQIDNO.3所示序列的引物ITSF：5’- CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3’以及具有SEQIDNO.4所示序列的引物ITSR：5’- ATCCACCGCTAAGAGTTGTCAG-3’组成。

2.用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的试剂盒，其特征在于，包含权利要 求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含以下试剂中的一种或多种：PCR用 的缓冲液、dNTP、耐热的DNA聚合酶、克隆载体、DNA连接酶、连接反应用的缓冲液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述耐热的DNA聚合酶为TaqDNA聚合 酶、LATaqDNA聚合酶、pfuDNA聚合物或其他用于在PCR反应中合成DNA的DNA聚合酶，或这 些DNA聚合酶的组合。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶。

6.根据权利要求2-5所述的试剂盒，其特征在于，所述克隆载体选自pMD18-T、pBR系列 载体、PUC系列载体以及其他用于原核扩增的质粒载体。

7.一种鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待鉴定个体的DNA、黄颡鱼的DNA和长吻鮠的DNA；

2)以步骤1)中得到待鉴定个体的DNA为模板，使用权利要求1中所述的用于扩增COI基 因的引物对PCR扩增COI基因；

3)将步骤2)得到的扩增产物克隆至克隆载体上，然后用携带有所述扩增产物的克隆载 体转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落测序；

4)利用遗传分析软件将步骤3)测序得到的序列与SEQIDNO.5所示的标准黄颡鱼COI 基因序列和SEQIDNO.6所示的标准长吻鮠COI基因序列构建进化树，通过聚类结果判定所 述待测个体的母本，如果步骤3)所得到的序列与SEQIDNO.5聚类到一枝，则母本为黄颡 鱼，如果与SEQIDNO.6聚类到一枝，则母本为长吻鮠；

5)分别以步骤1)中得到待鉴定个体的DNA、黄颡鱼的DNA和长吻鮠的DNA为模板，使用权 利要求1中所述的用于扩增ITS序列的引物PCR对扩增ITS序列；

6)将步骤5)中扩增得到的三种DNA片段进行琼脂糖电泳，如果从所述待鉴定个体扩增 到600bp和700bp长的两条扩增带，则所当步骤4)确定所述待鉴定个体的母本为黄颡鱼时， 所述待鉴定个体的父本为长吻鮠，当步骤4)确定所述待鉴定个体的母本为长吻鮠时，所述 待鉴定个体的父本为黄颡鱼。

8.根据权利要求7所述的鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的方法，其特征在 于，步骤4)中用到的所述遗传分析软件为MEGA。