[发明专利]用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的引物组、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖领域，更特别地涉及用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本 和母本的引物组、试剂盒和方法。

背景技术

杂交育种是一种重要的鱼类育种方法，其是利用具有优良性状的品种、品系或个 体进行杂交，产生新的优良性状，使后代获得遗传改良，出现可利用的杂种优势。在我国先 后通过杂交育种技术成功培育出了丰鲤、荷元鲤、岳鲤、芙蓉鲤、奥尼罗非鱼、杂交鳢、赣昌 鲤鲫、杂交鲌“先锋1号”、杂交翘嘴鲂等一大批水产杂交新品种，在水产养殖中起到了重要 的作用。

鲿科鱼类在我国广布于长江、珠江、黑龙江和黄河流域，包括4个属30多个种。由于 其肌间刺少、肉质细嫩、营养丰富等特点，已经成为我国重要的水产养殖对象。近年来，越来 越多的鲿科鱼类正被开发和利用，黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼、乌苏拟鲿、长吻鮠等众多鱼类被用 以养殖生产实践中，同时也有利用它们生产杂种后代进行研究和养殖的。然而，截止目前鲿 科鱼类的分类仍旧存在一定的问题，分类地位混淆。杂交生产的杂种后代由于从外部形态 特征上难以区分，从而为种质资源的鉴定更加增加了难度。如果杂种个体从养殖场逃逸将 带来潜在危害，可能会引起基因资源的污染和一些种群或种的消失。

精确鉴定杂种个体对于制定杂交育种方案，有效地管理育种计划，监测其负面影 响，和水产养殖业的可持续发展具有重要的作用。黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)和长 吻鮠(Leiocassislongirostris)的杂交工作已经开始，其后代表现出良好的生长优势，但 是截至目前仍旧没有可以用于鉴定其后代的方法，因此发明一种可以用于其杂种个体鉴定 的方法尤其必要。

发明内容

本发明基于COI基因和ITS序列在进化上的适度保守性为解决上述技术问题提供 了如下技术方案：

用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的引物组，包括以下引物：

用于扩增COI基因的引物对，由具有SEQIDNO.1所示序列的引物COIF以及具有 SEQIDNO.2所示序列的引物COIR组成；

用于扩增ITS序列的引物对，由具有SEQIDNO.3所示序列的引物ITSF以及具有 SEQIDNO.4所示序列的引物ITSR组成。

本发明还提供了用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的试剂盒，其包含 上述引物组。

进一步地，所述试剂盒还可包含分子克隆中所用到的PCR试剂、克隆载体、连接反 应所需的试剂等。

PCR试剂主要有PCR用的缓冲液、dNTP、耐热的DNA聚合酶。其中，所述耐热的DNA聚 合酶可为TaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶、pfuDNA聚合物或其他用于在PCR反应中合成 DNA的DNA聚合酶，或这些DNA聚合酶的组合。

所述克隆载体选自pMD18-T、pBR系列载体、PUC系列载体以及其他用于原核扩增的 质粒载体，或其衍生载体。

连接反应所需的试剂包括DNA连接酶、连接反应用的缓冲液。其中，所述DNA连接酶 可为T4DNA连接酶。

本发明还提供了一种用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的方法，包括 以下步骤：

1)提取待鉴定个体的DNA、黄颡鱼的DNA和长吻鮠的DNA；

2)以步骤1)中得到待鉴定个体的DNA为模板，使用权利要求1中所述的用于扩增 COI基因的引物对PCR扩增COI基因；

3)将步骤2)得到的扩增产物克隆至克隆载体上，然后用于转化大肠杆菌感受态细 胞，挑取单菌落测序；

4)利用遗传分析软件如MEGA将步骤3)测序得到的序列与SEQIDNO.5所示的标准 黄颡鱼COI基因序列和SEQIDNO.6所示的标准长吻鮠COI基因序列构建进化树，通过聚类 结果判定所述待测个体的母本，如果步骤3)所得到的序列与SEQIDNO.5聚类到一枝，则母 本为黄颡鱼，如果与SEQIDNO.6聚类到一枝，则母本为长吻鮠；

5)分别以步骤1)中得到待鉴定个体的DNA、黄颡鱼的DNA和长吻鮠的DNA为模板，使 用权利要求1中所述的用于扩增ITS序列的引物PCR对扩增ITS序列；