[发明专利]一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法

权利要求书

1.一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法，其特征在于，所述毛囊干细胞为大鼠毛囊干细胞，所述联合鉴定方法包括血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测、血管内皮细胞标记物的流式检测、血管内皮细胞的超微形态检测以及血管内皮细胞的体外功能检测；

首先，进行血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测，用于定性地表示内皮细胞标记物的表达位置，用于大致表达毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的情况；

其次，进行血管内皮细胞标记物的流式检测，用于定量地检测内皮细胞标记物的阳性率；

再次，进行血管内皮细胞的超微形态检测或体外功能检测，所述超微形态检测用于证明内皮细胞特有的W-P小体的存在，所述体外功能检测用于检测内皮细胞的功能。

2.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法，其特征在于，所述血管内皮细胞标记物为CD31和VE-cadherin。

3.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法，其特征在于，血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测包括如下步骤：

（1）诱导后的细胞用普通胰酶-PBS（1:3）稀释液漂洗3次，再用TrypLE?Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化5min，1200转/5min离心；

（2）以1×105/孔浓度接种于事先用Matrix胶包被在37℃、5%CO₂的培养箱中30min的玻片上，贴壁培养1d；

（3）吸去诱导培养基，用1XPBS洗3次；

（4）4%PFA-PBS于室温下固定10min；

（5）1XPBS洗3次，5min/次；

（6）1%BSA-PBS于室温下封闭30min；

（7）1XPBS洗2次，5min/次；

（8）孵化一抗，每滴15-25UL一抗稀释液，4℃过夜；

（9）1XPBS洗3次，5min/次；

（10）孵化二抗，避光1h；

（11）1XPBS洗3次，5min/次；

（12）DAPI染核，室温下10min；

（13）1XPBS洗2次，5min/次；

（14）封片，激光共聚焦下拍照。

4.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法，其特征在于，血管内皮细胞标记物的流式检测包括如下步骤：

（1）诱导后的细胞用普通胰酶-PBS稀释液漂洗3次，再用TrypLE?Select(1X)胰蛋白酶替代酶消化5min，1200转/5min离心，之后1XPBS洗2次；

（2）80%甲醇将细胞轻轻吹打成单悬液，室温固定5min，1200转/3min离心弃上清；

（3）0.1%PBST将细胞轻轻吹打成单悬液，室温静置20min，1200转/3min离心弃上清；

（4）5%BSA-PBS将细胞轻轻吹打成单悬液，上摇床封闭30min，1200转/3min离心弃上清；

（5）1XPBS洗1次，1200转/3min离心弃上清；

（6）每管流式管100UL（1Xannexin-bindingbuffer)，1×106cell；

（7）加一抗，避光静置30min；

（8）1XPBS洗1次，1200转/3min离心弃上清；

（9）加二抗，避光静置30min；

（10）1XPBS洗1次，1200转/3min离心弃上清；

（11）1XPBS每管流式管500UL，上机流式检测。