[发明专利]一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于皮肤组织工程学领域的生物检测方法，尤其是涉及一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法。

背景领域

皮肤作为人体最大的器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。随着社会经济的发展，特别是作为“世界工厂”的我国制造业和手工业的繁荣发展，各种涉及皮肤缺损的外伤特别是烧伤、压轧伤、切割伤等也越来越多。其中，外伤导致的皮肤大面积缺损常常导致非常严重的肢体残疾，甚至死亡。目前临床上治疗皮肤缺损的标准治疗方法是自体皮肤移植，由于具有无免疫排斥反应，成活率高等特点，其在临床上应用极为广泛，并取得了很好的疗效。但自体皮肤移植的缺点也非常明显，由于是自体取材，其本身就是对患者的再次损伤，极大增加了患者痛苦，而且有发生供皮区感染，不愈合等并发症的风险。更为严重的是，对于上述的大面积皮肤缺损，常由于缺乏足够可供移植的自体皮肤而导致创面修复困难，严重影响了治疗进程，甚至导致死亡。

虽然目前已有以上数种人工皮肤产品可供临床选择，也确实促进了对大面积皮肤缺损患者的临床治疗。但是，根据我们多年临床应用过程中遇到的问题，结合文献报道，我们认为目前人工皮肤移植还存在着许多问题，其中甚至包括可能导致治疗最终失败的“硬伤”：①由于以上人工皮肤产品都没有血管生成能力，导致移植的人工皮肤没有血管系统供给营养，从而使人工皮肤容易发生坏死，使移植失败。②人工皮肤产品中所含的各种异体细胞容易引起免疫排斥反应，临床上常出现移植的皮肤坏死、脱落，严重的甚至出现全身免疫反应等严重并发症，并且有可能传播疾病。③目前所有的人工皮肤产品都只能恢复正常皮肤的部分解剖结构和生理功能，而无法再生具有重要功能的皮肤附属器结构，例如：血管、毛发、汗腺等。

1997年，Asahara等（AsaharaT,etal.1997)首次发现人体外周血中存在能分化为ECs的前体细胞，将其命名为EPCs。EPCs不仅参与胚胎期的血管发生，而且在成体的血管生长发育中发挥重要作用。但EPCs主要存在于骨髓和外周血中，其来源和数量非常有限，获取的细胞纯度较低、增殖能力较差，能够成功分化成ECs的效率更低，而且多个部位穿刺取材对患者的损伤大（GehlingUM,etal.2000；CasamassimiA,etal.2007）。此外，ECs在血管的发生和形成过程中也演绎着非常重要的角色。然而，ECs自体取材来源有限，取材后极易引起桥血管的狭窄、闭塞，易加重对患者的损伤，且经过原代分离培养的血管内皮细胞极易老化，细胞周期短，增殖能力非常局限。这些都限制了ECs的直接获取和应用。遂考虑利用干细胞诱导的方法。

研究表明，毛囊干细胞（HairFollicleStemCells,HFSCs）是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点(CotsarelisG,etal.1990,CotsarelisG.2006)。体外培养的HFSCs表现出高克隆形成能力，具有非常高的再生潜能(RochatA,etal.1994)。它来源于皮肤、毛发，数量极其可观，且没有严重的并发症，无免疫原性，可供自体移植，是最容易获得的干细胞来源之一。Stelios等发表的最新研究结果证明，已成功将毛囊干细胞分化发育生成新的脉管系统。而血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）是血管内皮细胞生长因子5种亚型之一，其活性最强，分布范围最广，是VEGF体内发挥作用的主要亚型。近年来围绕VEGF165为中心的血管再生性基因治疗研究成为国内外研究热点。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题在于提供一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法，为此，本发明提供如下技术方案：

一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的联合鉴定方法，其特征在于，所述毛囊干细胞为大鼠毛囊干细胞，所述联合鉴定方法包括血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测、血管内皮细胞标记物的流式检测、血管内皮细胞的超微形态检测以及血管内皮细胞的体外功能检测；

首先，进行血管内皮细胞标记物的免疫荧光检测，用于定性地表示内皮细胞标记物的表达位置，用于大致表达毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的情况；

其次，进行血管内皮细胞标记物的流式检测，用于定量地检测内皮细胞标记物的阳性率；

再次，进行血管内皮细胞的超微形态检测或体外功能检测，所述超微形态检测用于证明内皮细胞特有的W-P小体的存在，所述体外功能检测用于检测内皮细胞的功能。