[发明专利]一种识别糖的快速方法

权利要求书

1.一种利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化结合离子淌度串联质谱识别人参中低聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)氨水-甲醇溶液配制

NH₃·H₂O加入到甲醇中充分振荡，得到浓度为0.75-0.9mol/L的氨水-甲醇溶液；

(2)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生液配制

将1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮配制成浓度为0.0349mol/L的溶液，保存于4℃冰箱中备用；

(3)人参低聚糖样品的提取、分离、富集

将干燥的人参根粉碎至50～80目，在室温下用蒸馏水浸泡过夜，70℃下提取2～3h，四层纱布过滤，残渣再反复提取2次；合并3次提取液，3500rpm离心15min后，弃去沉淀，合并上清液；将上清液旋转蒸发、冻干后得到人参粗低聚糖样品；将粗低聚糖样品与水以质量比7：1000混合，用截留分子量为3000Da的超滤膜进行超滤分级，滤出液用苯酚-硫酸法实时监控，直到没有颜色为止；收集滤出液，旋转蒸发浓缩后，冻干得人参低聚糖样品；将所得样品溶解于水中，10000rpm离心5min后，将上清液上至平衡好的1.0cm×100cm Bio-gel P-2凝胶层析柱；然后用去离子水洗脱，流速为0.06mL/min，收集洗脱液；从每管中取出0.2mL洗脱液，用苯酚-硫酸法测定其中的糖含量，并绘制层析图；根据洗脱曲线收集人参低聚糖样品1和人参低聚糖样品2的洗脱液；

(4)标准品和提取物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化过程

标准品：反应总体积为200μL，2.5mmol/L的单糖或二糖标准品，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生液补足；

提取物：反应总体积为200μL，终浓度为10g/L的人参低聚糖样品1及人参低聚糖样品2混合物，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生液补足；标准品和提取物在10000rmp离心，取上清液，于60～80℃温水浴中反应1～2h；反应后，离心取上清液用高纯N₂吹干，加Milli-Q水充分溶解后，10000rmp离心10min，取上清液加CCl₃充分振荡，静置后除去下层溶液，反复多次，直到下层无颜色，最终得到样品的衍生化产物，置于4℃冰箱中；

(5)质谱条件

质谱仪：Waters Synapt G2质谱仪，离子源：电喷雾电离源正离子模式，毛细管电压：2.8kV，样品锥孔电压：50V，萃取锥孔电压：4V，源温度：120℃，脱溶剂气温度：350℃，锥孔气流速：30L/h，T-wave速率：550-2500m/s，T-wave高度：38～40V，漂移气体为氮气，流速：90mL/min，碰撞气体为氩气，trap碰撞能量：35～40V；标准品和提取物均按上述质谱条件进行分析。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中氨水-甲醇溶液的浓度为0.82mol/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生液是由0.82mol/L的氨水-甲醇配制而成。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的标准品和提取物在70℃温水浴中反应2h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的T-wave速率为550～2500m/s，T-wave高度为40V。