[发明专利]一种识别糖的快速方法

说明书

本发明涉及PMP(1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮)衍生化结合离子淌度串联质谱(IM‑MS/MS)的方法，其解决了现有识别寡糖异构体技术中，无法简单、快速、准确的分析实际混合的糖样品的问题，同时解决了利用质谱手段无法确定糖的单糖残基组成的问题。本发明对比了PMP和苯肼(PHN)为衍生化试剂结合IM‑MS/MS方法对糖的异构体进行识别的效果，并从理论上对衍生化产物的碰撞截面(CCS)值进行了计算，进一步证实用PMP衍生化结合IM‑MS/MS方法可成功对糖的混合提取物进行定性鉴定，并且可同时鉴定糖的连接、构型和组成。

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生化结合离子淌度串联质谱（IM-MS/MS）识别糖的方法，具体而言，涉及天然产物提取物中糖结构鉴定的PMP衍生化结合离子淌度串联质谱的方法。

背景技术

寡糖是生物体内重要的信息物质，糖在多种生物过程中起重要的作用，如抗凝活性、免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抑制致病微生物、抗氧化、抗炎活性等（X. Zhang. Curr.Med. Chem. 2006, 13, 1141-1147; S. Hakomori. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.2002, 99, 225-232.）。糖的连接、构型、单糖残基组成一直是糖的结构研究的难点，糖链结构的复杂性和技术手段的局限性，对糖链的结构的分析远远滞后于对其功能的研究，严重制约了糖链结构与功能关系的研究。而这种生物来源的样品往往分离纯化的难度也很大，经常得到非常微量的混合物，目前还没有任何一种分析技术能解决以上所有问题，迫切需要建立快速、有效的方法分析糖的混合异构体。

传统的分析寡糖的方法包括核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱（GC/MS）和高效液相色谱（HPLC）的结合（H. A. Currie, C. C. Perry. J. Chromatogr., A 2006, 1128, 90-96.）。但NMR灵敏度低，对样品纯度要求高，目前在天然样品的分析中无法得到广泛应用。HPLC法比较耗时，而且在区分异构体方面也不是特别有效。具有快速、灵敏等优点的质谱法在糖的结构分析方面起到了重要的作用，特别是IM-MS的出现。它是一种基于离子在飘移管中与缓冲气体碰撞时的碰撞截面（CCS）不同，离子可按大小和形状进行分离的技术。IM-MS与传统质谱最大的区别在于质谱的质量分析器之前增加了一个离子漂移管。这个漂移管中充有惰性气体比如氮气或者氦气，当离子在漂移管中运动时，运动着的离子会和惰性气体分子碰撞，即使所带电荷相同，质量相似而形状、尺寸不同的离子与惰性气体碰撞时横截面积也不相同，即离子运动的“阻力”不同，使得离子通过漂移管的时间长短不一，达到通过形状区分离子的目的。它的快速、独特的气相离子分离能力使得它成为分析糖异构体的理想的工具，已成功用于糖的结构的鉴定。在负离子模式下通过添加阴离子，利用IM-MS/MS结合HPLC能够较好的区分从牛下颌腺粘蛋白分离得到的糖异构体（H. Li, B. Bendiak, W. F.Siems, D. R. Gang and H. H. Hill. Anal. Chem. 2015, 87, 2228−2235.），但分析对象为三糖以上的连接、构型异构体，结构差别明显。利用IM-MS分离分子量比较小的糖尚未完全分开（H. Li, K. Giles, B. Bendiak, K. Kaplan, W. F. Siems, H. H. Hill.Anal. Chem. 2012, 84, 3231-3239.）。近期发表在nature上的一篇文献中研究者们利用IM-MS鉴定了6个三糖异构体的连接和异头碳，但组成异构体无法进行区分（J. Hofmann,H. S. Hahm, P. H. Seeberger, K. Pagel. Nature 2015, 526, 241-244.），可见确定糖的单糖残基组成确实是个难点。

可见，目前使用IM-MS对糖的结构鉴定一直存在较大的技术困难，即使对糖进行衍生化后，结构接近的糖分离也难以做到有效区分。研究人员一直期待找到对结构相近的糖快速有效的分析手段。